Шухрат Миталипов: «Нужна эффективность редактирования не менее 90%»

Редактировать или не редактировать геном человеческих клеток зародышевой линии? Об этом спорят на научных конференциях и в соцсетях. Начала работу международная комиссия, которая собирается определить научные, медицинские и этические требования к технологии, претендующей на клиническое применение. На вопросы  по этой волнующей теме - что можно сделать технически, что разрешено юридически и что нас ожидает в будущем - отвечает Шухрат Миталипов.

В Великобритании уже начались клинические испытания митохондриальной заместительной терапии. А когда, по вашему мнению, появятся технологии редактирования ядерного генома клеток зародышевой линии, готовые для клинических испытаний?

Трудно сказать. Пока еще технология не отработана до конца: репарация мутаций в геноме не очень эффективна, к тому же безопасность довольно проблематична. Наверное, потребуется еще лет пять-десять. Сейчас пока вроде рановато говорить о клинических испытаниях.

Определенно не год, не два?

Да. Если мы изучаем эмбрионы, которые не будут имплантироваться женщине для получения беременности, то эти исследования нужно вести, можно что-то делать с помощью CRISPR. В этом случае репарация мутаций происходит в довольно малом проценте эмбрионов, зато CRISPR часто вызывает дополнительные мутации. CRISPR обычно разрезает ДНК в определенном месте, а потом сами клетки - в нашем случае эмбрионы - пытаются зашить этот разрезанный участок. Чаще всего для этого они используют NHEJ - негомологичное соединение концов ДНК. И обычно несколько нуклеотидов после зашивания бывают потеряны либо, наоборот, встроены - это называется индел-мутации, небольшие инсерции и делеции. Конечно, для терапевтических приложений это нежелательно. Есть другие, более сложные механизмы ДНК-репарации, которые называются HDR, - исправление по гомологичному участку, без инделов. Было бы оптимальным, если бы все эмбрионы использовали именно HDR, но, как правило, в 95-99% случаев мы получаем новую мутацию вместо того, чтобы залечить существующую.

В вашем обзоре коротко говорилось про подходы, которые могут повысить точность редактирования и безопасность. Расскажите немного об этом.

Как заставить клетку не использовать NHEJ, а использовать HDR? Мы пока плохо знаем, какие механизмы тут задействованы. Видимо, более-менее эффективно можно залечить мутацию, если она присутствует только на одной хромосоме. CRISPR разрезает мутантный участок гена, а на второй хромосоме, полученной от другого родителя, нет мутации, ее CRISPR не узнает, потому что сиквенс немножко другой. И вот клетка использует эту вторую копию как матрицу - это и есть гомологичная репарация, HDR. Но, к сожалению, и она не совсем безопасна, потому что во многих случаях, когда клетка начинает копировать гомологичную последовательность из другой хромосомы, она копирует не только маленький участок, где была мутация и мы сделали разрез, - иногда копируется чуть ли не вся хромосома. При этом происходит то, что называется потерей гетерозиготности. Есть опасность, что на этой второй хромосоме, с которой шло копирование, хотя и нет той мутации, которую мы хотим исправить, есть другие рецессивные мутации, незаметные в гетерозиготном состоянии. И они теперь скопируются на обе копии, - получается, что мы их раскрываем, они становятся гомозиготными и проявляются. Потеря гетерозиготности в медицинской генетике никогда не считалась полезной. Сначала мы обрадовались, что есть такая репарация, но теперь у нас есть данные, что иногда это копирование уходит слишком далеко, а если так, то клинически это не очень безопасно.

Самый безопасный выход - использовать короткую синтетическую матрицу, которую мы подаем внутрь клетки сами. Но вот она как раз используется очень, очень редко, не более чем в 5% случаев. Пока еще неизвестно, почему. А нам-то нужна эффективность не менее 90%, чтобы можно было сказать: «Да, мы готовы для клинических испытаний». Это значит, что я взял 10 эмбрионов и в 9 точно убрал мутацию, и нет никаких побочных эффектов. А сейчас обратная пропорция: может быть, в 5% мы исправляем, а в остальных эмбрионах создаем дополнительные мутации. Методы редактирования, которые в основном используются сейчас, пока недостаточно эффективны, во всяком случае, для клеток зародышевой линии. У генной терапии на соматических клетках другие критерии - даже если удалось исправить мутации в 1% клеток, дадут зеленый свет, можно будет делать клиническое испытание. В случае клеток зародышевой линии требования более строгие, мы их сами же определяем, имея в виду то, как общество, пациенты на это смотрят. Если бы мы начали делать клиническое испытание с существующей сегодня эффективностью, вряд ли бы нас кто-то понял. Сейчас не решена чисто технологическая проблема: нет метода, который помог бы нам делать это эффективно и безопасно.

А если родители гомозиготны по мутации, связанной с болезнью, тут поможет только добавление внешней матрицы?

В этом случае да. Нет смысла копировать из одной хромосомы в другую, если оба гена мутантные. Тут точно надо искусственную, синтетическую матрицу. Но как раз у этой матрицы эффективность мала, и никто не знает, как ее увеличить.

Были рекомендации редактировать клетки зародышевой линии только при тяжелых заболеваниях и только у гомозиготных по мутации родителей, а в других случаях использовать другие методы, например, отбор эмбрионов при ЭКО…

Рекомендации были разные. Я в принципе с этим не согласен, потому что таких случаев почти не бывает. Большинство заболеваний в гомозиготном состоянии очень тяжелые, такие люди, к сожалению, не доживают до репродуктивного возраста. А если доживают, каков шанс, что он или она найдет себе пару с тем же самым заболеванием, и тоже гомозиготу? Получается, такие случаи настолько редки, что вряд ли вокруг них стоит поднимать шум. Поэтому метод надо применять в большинстве случаев, там, где мутации передаются от гетерозиготных родителей или один из родителей гетерозиготен.

Часто выдвигают аргумент, что есть преимплантационная генетическая диагностика, которая дает возможность отобрать немутантные эмбрионы после ЭКО. К сожалению, этот отбор связан с выбрасыванием половины эмбрионов, с этической точки зрения не совсем хорошая альтернатива. Лучше делать генную терапию, чтобы каждый эмбрион имел шанс выжить. Но это чисто этическая сторона дела, а есть и практическая. При ЭКО мы в основном работаем с несколькими эмбрионами, и у нас эффективность приживления эмбриона где-то 30%. А для пациентов с генетическими заболеваниями приходится половину или даже 75% выбрасывать - это уже будет 15% или меньше. В результате семьи должны проходить многие циклы ЭКО, прежде чем начнется беременность. Часто это женщины уже в возрасте, а с ними у нас вообще большие проблемы. И поэтому есть необходимость развивать генную терапию. Но опять же, пока у нас нет хорошего метода, о котором можно сказать: да, можно делать клинические испытания.

Вы не допускаете, что у Хэ Цзянькуя или Дениса Ребрикова такой метод есть?

Прежде всего, они же не корректируют никакую мутацию. Они индуцируют мутацию в нормальном, немутантном гене  CCR 5  путем NHEJ, что в принципе нетрудно сделать. В 99% случаев у вас получится индел-мутация. Но такие индел-мутации невозможно спрограммировать, их может быть сотни разных видов, и каждый эмбрион может получить новый индел. В случае резистентности к СПИДу нужна определенная мутация, а именно делеция размером в 32 нуклеотидов, которая встречается от природы у некоторых людей с ВИЧ-резистентностью. А такую с помощью NHEJ невозможно сделать. Поэтому им тоже надо использовать HDR и синтетическую матрицу, но опять мы приходим к тому, что HDR получается редко.

Мне кажется, если бы у кого-то была такая технология, они рассказывали бы прежде всего о ней, и это была бы бомба. А мы не видим таких публикаций…

Создается впечатление, что эти доктора не понимают, что делают. Они думают, если инъецировать CRISPR в эмбрионы, то все сработает. Да, что-то получится, вы индуцируете мутацию, но другую, не ту, которая дает резистентность. У нас и так большие проблемы с регуляцией генной терапии на эмбрионах, и, к сожалению, из-за таких безответственных людей становится еще больше трудностей для легитимных исследований. Регуляторные органы начинают требовать закрыть все исследования, вместе с водой выплескивают ребенка. Все эти случаи, конечно, не помогают нам, они наносят большой урон.

Недавно я прочитала в Science, как Национальные институты здравоохранения США разъясняют новую политику администрации президента по поводу любых работ с эмбриональными тканями: сотрудники NIH больше не могут с ними работать, а чтобы получить грант NIH, нужно долго доказывать, что тебе это нужно. Очень ли это плохо для вашей области?

Ну, в США вообще не разрешается использовать госфинансирование для экспериментов с эмбрионами, таких, которые мы делаем. Даже когда эмбрион не трансплантируют, а только изучают,- считается, что это уничтожение эмбриона. Но такие эксперименты необходимы, ведь мы не можем сразу эмбрион трансплантировать и смотреть, что получится, это надо смотреть  in   vitro . Однако в США давно существует запрет на финансирование любых экспериментов с человеческими преимплантационными эмбрионами. Даже если я получу линию эмбриональных стволовых клеток - и с такими клетками нельзя работать, используя государственное финансирование. Это ограничение существует давно, кажется, еще при Билле Клинтоне была принята поправка. А то, о чем вы говорите, это, наверное, вопрос о фетальном материале, полученном после абортов. Этот абортивный материал, который в любом случае был бы уничтожен, можно было использовать для каких-то исследований, для которых, видимо, государственное финансирование на каком-то уровне разрешалось. Сейчас администрация нашего действующего президента пытается через NIH закрыть и это финансирование.

Но если не использовать государственные деньги, то такие исследования можно легально проводить, что мы и делаем у нас в Центре. Все наши исследования делаются или на частные пожертвования, или на гранты от общественных, негосударственных организаций, фондов. Кроме того, у нас в университете есть огромное количество клиник, госпиталей, и они получают некоторую прибыль, которую университет инвестирует в науку, так мы получаем частичное финансирование.

Есть и другие запреты, не связанные с финансированием, в каждом штате свои. Даже с частными деньгами в большинстве штатов нельзя делать исследования, которые делаем мы. Насколько я знаю, Орегон - единственный штат, где это разрешается. С другой стороны, у нас есть, допустим, южные штаты - Техас, Алабама, где не разрешается вообще ничего. Даже работать с эмбриональными стволовыми клетками, хотя они и разрешены на федеральном уровне. Туда нельзя даже ввезти ампулу со стволовыми клетками, за это могут посадить. У нас в США довольно пестрая картина, даже аборты легальны в одних штатах и нелегальны в других. Вы, возможно, слышали: во многих южных штатах недавно запретили все аборты. (В Алабаме запрещены аборты на любой стадии, без исключений для беременности, наступившей в результате изнасилования или инцеста; в некоторых других штатах действует так называемый Закон о сердцебиении - аборт запрещен, если регистрируется биение сердца эмбриона, а современными методами его можно зарегистрировать весьма рано. -  PCR . news .) Большая волна сейчас поднимается во многих штатах, закрывают клиники. Пациентки, конечно, могут выехать в другой штат… Но факт в том, что это сложная тема, которая всегда была в центре внимания у политиков. И конечно, это задевает нас, тех, кто занимается наукой в этой области.

Тот ребенок после митохондриальной заместительной терапии у матери с синдромом Лея родился в Мексике ведь именно потому, что там это было не запрещено делать? Хотя технологию разработали вовсе не в Мексике.

Да, в США этого нельзя было делать. Некоторые частные ЭКО-клиники решили подзаработать. Они, по-моему, даже процедуру замены делали в американской клинике, в Нью-Йорке, затем отослали эмбрион в другую клинику в Мексике, пациенты поехали туда, и женщине имплантировали эмбрион. Насколько я знаю, родился ребенок не в Мексике, а в США или где-то еще, сами родители были, кажется, из Иордании.

Этот случай опять же не принес нам особой радости, потому что было много негатива, призывов все закрыть и прекратить исследования. Обвиняют нас, что мы разрабатываем эти технологии, публикуем результаты, частные ЭКО-клиники потом их копируют и применяют на пациентах несанкционированно. В Мексике не было запрета на митохондриальную заместительную терапию, но после этого случая там спохватились и запретили.

Была серая зона?

Да-да. Директор той клиники прямо заявлял: мы туда поехали, потому что там был Дикий Запад. Теперь, говорят, и у вас в России, и в Китае… А потом начинаются призывы к запретам, мораторию. К сожалению, вот эти наши коллеги портят всю картину.

А что произошло с вашими клиническими испытаниями?

Мы предлагали здесь, в Америке делать долгосрочные клинические испытания под строгим контролем, запросили FDA. И вроде бы сначала в FDA начали работать над этим, обсуждать методы, выборку, прочие детали. А потом в Конгрессе про это услышали, взяли и ввели запрет на финансирование таких клинических испытаний. FDA - государственная организация, им пришлось сразу расформировать комитет, который с нами работал, и мы опять остались ни с чем.

В каком году это было?

Мы начали с ними работать в 2012 году и работали года три. Они создали этическую комиссию, проводили много обсуждений, устраивали открытые конференции. Хотели, чтобы все было так же, как в Англии. Наша Академия медицины обсуждала это, по-моему, целый год, подготовила рекомендации. С этической точки зрения правильно, конечно: надо делать это под контролем государства. И в итоге - мы думали, что скоро начнем клинические испытания, но Конгресс сделал вот такое ограничение на финансирование. И мы всё надеемся, что это временно - Конгресс принимает бюджет каждый год, есть шанс на отмену этого решения. Но, к сожалению, каждый год они копируют эту поправку. И в этом году мы пытались ее убрать, и вроде бы Палата представителей согласилась, но потом сам Сенат опять вернул ее. Пока у демократов не будет большинства в обеих палатах парламента, вряд ли мы сможем это убрать.

А в чем суть претензий к митохондриальной заместительной терапии? Это же принципиально иной метод, чем редактирование ядерной ДНК, собственно, вообще не редактирование.

Они стоят на том, что это «перенос генов», gene transfer, что это ведет к генетической модификации генома человека, зародышевой линии, и поэтому неприемлемо. Такие вот этически-религиозные соображения. Мы говорим: там никакой модификации нету, так как мы не используем синтетических генов. Мы трансплантируем митохондрии от одного человека другому, так же, как трансплантируют донорский костный мозг либо сердце. Там тоже переносится генетический материал в клетках и тканях! Но они не считают трансплантацию органов или тканей «переносом генов». Наши политики старые, закоснелые, многих вещей не понимают. Им как объяснили, что это генетическая модификация, так они и решили это запретить.

Если бы законодательное регулирование редактирования геномов зародышевой линии зависело только от вас, что бы вы разрешили, что бы запретили?

Сейчас очень мало говорится про эффективность и безопасность. Я считаю, что если бы кто-нибудь пришел и сказал: «У меня есть метод с 90-99%-ной эффективностью, без побочных эффектов», - тогда, да, скорее всего, можно начинать клинические испытания. Но сейчас все в основном застряли на морально-этической стороне, и никто не знает, а что же с чисто научной и технологической точки зрения ожидать. Поэтому мы и написали наш недавний обзор в  Nature   Genetics , именно чтобы определить, что с научной точки зрения, даже если сейчас будет разрешение - мы не готовы к испытаниям редактирования геномов зародышевой линии, потому что эффективность абсолютно неприемлемая.

С митохондриальными генами ситуация получше, мы их заменяем донорским геномом, полностью или почти полностью, с 99%-ной эффективностью! Это делается на каждом эмбрионе вручную, и поэтому эффективность высокая. К сожалению, не 100%, так как один процент мутантной ДНК остается, это у нас всегда была проблемой - как ее полностью удалить. Но 99% - все-таки довольно хорошо. И поэтому мы считаем, что клинические испытания надо начинать. Но не так, чтобы каждая ЭКО-клиника имела право это применять. Начинать надо в отдельных клиниках, как экспериментальную процедуру, на больших выборках, публиковать данные. В особенности необходимо несколько лет проследить за детьми, чтобы ни у кого не оставалось никаких вопросов о безопасности и эффективности. Что, в принципе, и делается в некоторых странах. Вы сказали о Великобритании, но, правда, и они только одной клинике дали эту лицензию. И, по-моему, даже в этой клинике они для каждого отдельного случая должны получать отдельное разрешение. Насколько я знаю, только на две семьи разрешение дали недавно и еще не начали испытания.

Больше детей с заменой митохондрий нет?

Есть, но это делается не для лечения митохондриальных заболеваний, а для лечения бесплодия, в ЭКО-клиниках. Вы, наверное, слышали, в Греции уже начали это делать, но вроде бы они получили специальное разрешение использовать метод именно для бесплодия. Что-то делается на Украине, точно не знаю, что именно. Та же клиника в Нью-Йорке, которая производила замену митохондрий ребенку матери с синдромом Лея, тоже что-то делает на Украине теперь. Факт, что такой ребенок, скорее всего, не один. Наверное, их около десятка.

Для лечения бесплодия тоже переносят материнское ядро в донорскую цитоплазму?

Технология идентичная. Мы делаем перенос, потому что женщина, возможно, молодая, с фертильностью проблем нет, но митохондрии в цитоплазме мутантные, и мы полностью заменяем цитоплазму на донорскую, вместе с митохондриями. А в другом случае, возможно, нет никаких митохондриальных мутаций, но сказывается возраст, женщины еще могут производить яйцеклетки, но из них, как правило, не развиваются нормальные эмбрионы. А возраст влияет в основном на цитоплазму. Так что идея та же самая: меняем цитоплазму на донорскую, которую берем у молодой женщины.

То есть когда мы это называем вспомогательной репродуктивной технологией, это делать можно, а когда митохондриальной заместительной терапией - то это перенос генов и нельзя?

И то, и другое подлежит регулированию. Допустим, в Англии технология разрешена только для митохондриальных заболеваний, но не для лечения бесплодия. Потому что они хотят увидеть данные, показывающие, что технология действительно работает для бесплодия. Но мы говорим: если вы не разрешаете эксперименты, откуда же мы возьмем эти данные? Конечно, на мышах, на обезьянах мы все это делаем, но проблема возрастного бесплодия у женщин - чисто человеческая. Многие клиники кинулись делать это, вот и клиника в Афинах - у них в фокусе не митохондриальные заболевания, а бесплодие. Возрастные женщины, которые делали несколько ЭКО со своими яйцеклетками, некоторые даже до 10 ЭКО-попыток, и ничего не получилось. Обычно в таких случаях советуют взять донорскую яйцеклетку, но если семьи не хотят, тогда берут только цитоплазму донорскую, а ядро оставляют свое. Но они довольно жестко отбирают для этих испытаний такие бесплодные семьи, которые перепробовали все, и это последний шанс.

Еще спрошу про регуляторику. Есть ли какие-то признаки, что паника закончится, и от запрещения всего мы перейдем к разрешению полезного и необходимого?

Я уже говорил, что в США мы этого делать не можем. Говорят: нам нужен общий запрет на уровне ВОЗ. Но ВОЗ может только рекомендовать, а каждая страна будет решать сама. Там такая каша - все стремятся регулировать, у всех свое мнение, в основном этические соображения. Примерно так же было, когда в первый раз получили рекомбинантную ДНК, стремились запретить все сразу, а потом поняли, что ничего плохого в этом нет, ДНК есть везде, и рекомбинация постоянно происходит. И все эти комитеты давно отменили. Но сейчас, с CRISPR и зародышевыми клетками, идет новая волна разбирательств, каждый хочет регулировать, никто, правда, толком не знает, как и что. Привлекают в основном специалистов по этике, политиков, но при этом очень мало людей, которые что-то понимали бы в редактировании генома эмбрионов.

Это, конечно, неправильно.

Да, надо бы работать с людьми, которые занимаются ЭКО. У нас есть профессиональные общества, и в Европе, и здесь в США, и в России, конечно, есть. И никого из этих обществ не пригласили. Собираются регулировать ЭКО в отсутствие специалистов по ЭКО, что нам не очень нравится.

В вашей статье говорится, что запреты на технологии приведут к уходу в серую зону: и исследователи, и родители, которым нужна подобная медицинская помощь, просто поедут туда, где это не запрещено, в условную Мексику.

Да, и когда наше правительство запретило делать клинические испытания здесь, мы сказали: это невозможно запретить. Ну да, мой университет, моя клиника, наш центр не будут этого делать, никто в США не будет, но есть другие страны, где это не регулируется. Запретить невозможно, и в основном из-за этого будут страдать пациенты. Вместо того, чтобы с ними работали квалифицированные специалисты, и там, где у них есть медицинская страховка - теперь они поедут в частные клиники, с непроверенными технологиями, где непонятно что с ними будут делать. У нас спрашивают семьи: как вы думаете, стоит нам поехать туда-то или туда? Нам нужно, у нас время уходит. Но я ничего не знаю об этих клиниках, не могу их рекомендовать.