Внеклеточная ДНК, как биомаркер старения и различных патологий

Мы уже рассказывали вам про циркулирующую микроРНК, но есть еще одна не менее крутая штука - внеклеточная циркулирующая ДНК (англ. cell-free DNA, circulating DNA). Открыта она была ещё 1948 году. Сейчас к ней усилился интерес, и вот в чём, собственно, дело.

Внеклеточная ДНК (вкДНК) обнаруживается в нескольких жидкостях организма: в плазме и сыворотке крови, моче, слюне, синовиальной, перитонеальной и спинномозговой жидкости.
Мы с вами рассмотрим особенности вкДНК в двух жидкостях: крови и моче. Понятно дело, что так удобней для диагностики.

Источники вкДНК в организме

Как стало известно, вкДНК циркулирует в крови в составе апоптотических телец, микровезикул, нуклеосом, экзосом, нуклеопротеиновых комплексов с белками крови и, предположительно, в свободном виде.

Считается, что источниками возникновения вкДНК в крови являются процессы гибели клеток, созревание эритроцитов, секреция ДНК клетками, а также бактерии и вирусы. Сразу отметим, что последний источник, ДНК бактерий и вирусов, вносят очень незначительный вклад в общий пул циркулирующей ДНК, и уровень экзогенной ДНК во время инфекций не превышает нескольких десятков пкг/мл. Тогда как по современным данным нормальный уровень вкДНК в здоровом организме составляет 3-44 нг/мл в плазме и 50-100 нг/мл в сыворотке крови.

Значительная часть вкДНК в организме, вероятно, появляется в результате гибели клеток, в процессе апоптоза, некроза и нетоза. Ежедневно в организме взрослого человека посредством программируемой клеточной гибели (апоптоза) гибнет около ста миллиардов клеток, в результате чего деградирует около 1г ДНК в сутки.

В процессе апоптоза ядерная ДНК расщепляется специальным ферментом ДНКазой. После чего появляются фрагменты ДНК длиной кратной нуклеосоме (180-200 п.н., п.н. - пар нуклеотидов), которые в составе апоптотических телец (специальной упаковки после апоптоза) должны быть утилизированы макрофагами. Все знают, что пары нуклеотидов (аденин-тимин и гуанин-цитозин) в нашей ДНК повторяются три миллиарда раз. Нуклеосомы - специальные структуры в составе хроматина, состоящие из белков-гистонов, на которые в полтора оборота наматывается нить ДНК.

Дальше происходит странное. По непонятным причинам часть ДНК погибших клеток избегает встречи с макрофагами и попадает в кровь. В разное время проводились эксперименты, подтверждавшие апоптотическую природу вкДНК [1,2].

При разделении вкДНК плазмы здоровых доноров с помощью гель-электрофореза обнаруживаются полосы, соответствующие длинам фрагментов 180-200 п.н. и длинам, кратным этому числу, что соответствует межнуклеосомному расщеплению хроматина при апоптозе. Обнаружение ДНК плода в крови матери также говорит в пользу апоптоза как источника вкДНК [3].

В норме некроз вносит менее значительный вклад в появление вкДНК, увеличивая её количество при тяжёлых травмах. Некротическая вкДНК в плазме обнаруживается в виде более длинных фрагментов - длиной свыше 10 тысяч п.н. С помощью метода ПЦР (полимеразной цепной реакции) возможно различить длинные фрагменты вкДНК, появляющиеся в результате некроза, и более короткие фрагменты - из-за апоптоза.

Кроме апоптоза и некроза существует ещё один малоизвестный вид клеточной гибели, являющийся источником вкДНК - нетоз (NETosis).

При нетозе клетки-нейтрофилы выбрасывают специальные сетеподобные структуры, внеклеточные нейтрофильные ловушки (NET, Neutrophil Extracellular Trap), задача которых - дезактивация проникшего в организм патогена: вирусов, грибов и бактерий. При этом нейтрофил гибнет, выбрасывая ДНК, гистоны, различные белки и ферменты во внеклеточное пространство. Известно, что иногда процесс NET носит патологический характер, способствуя развитию тромбоза, сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваний, а также рака.

Недавно, в 2018 году, было обнаружено, что при ВИЧ-инфекции происходит гиперактивация нейтрофилов, механизма NET и нетоза. В результате чего происходила обширная гибель иммунных клеток, захваченных сетями нейтрофилов, CD4+ и CD8 + Т-клеток, В-клеток и моноцитов, и развитие сопутствующих сердечно-сосудистых патологий [4].

Ещё один потенциальный источник вкДНК - секреция ДНК нормальными и опухолевыми клетками. Ещё в 1972 году было получено доказательство активного выделения ДНК лимфоцитами во внеклеточную среду [5].

Наличие такое феномена, как выделение ДНК клетками во внеклеточную среду, предполагает существование специальных механизмов переноса ДНК через клеточную мембрану. В ходе исследований было установлено, что высвобождение ДНК из лимфоцитов происходит при активном действии трипсина, проназы и плазмина на фоне дефицита ионов Са2+ и Mg2+. Избыток же ионов кальция ингибирует выход ДНК из клетки [6].

По мнению российских биохимиков из Казанского государственного университета, ещё одним вероятным источником вкДНК в крови может быть совсем неизвестная форма цитоплазматической ДНК, отличная от ядерной и митохондриальной - ДНК, ассоциированная с мембраной диплоидных лимфоцитов человека (Membrane-Associated DNA in the Cytoplasm of Diploid Human Lymphocytes) [7].

Несмотря на то, что этот тип ДНК был открыт в 1971 году, он и сейчас остаётся неизученным, и по нему есть считанные работы одних и тех же авторов, хотя и в PNAS и Nature.

По предположению Абрамовой З.И. с соавторами какая-то часть вкДНК может формироваться из этой цитоплазматической ДНК, на что указывают характерные особенности некоторых фрагментов вкДНК, отличные от ядерной и митохондриальной [6].

Рис.1 Различные пути, которыми вкДНК попадает в циркуляцию.

Более подробно обо всех аспектах биологии вкДНК (иммуномодулирующих эффектах, рецепции к вкДНК на поверхности клеток и пр.) можно прочесть в подробном обзоре профессора Козлова В.А. (НИИ клинической иммунологии СО РАМН) [8].

Внеклеточная ДНК как биомаркер при различных патологиях

Логика подсказывает, что уровни вкДНК должны изменяться при патологиях, которые сопровождает массовая клеточная гибель. В ряде исследований было показано значимое повышение уровней вкДНК при развитии аутоиммунных заболеваний (системной красной волчанки, системной склеродермии, ревматоидного артрита и др.) и что существуют характерные особенности вкДНК, типичные для определённой аутоиммунной патологии [8-10].

Также известно, что при остром инфаркте миокарда, который сопровождает гибель клеток сердца по типу как некроза, так и апоптоза, уровни вкДНК также повышаются. И это имело потенциальное диагностическое значение, поскольку у пациентов, у которых развились осложнения, были более высокие уровни, чем у тех, кто восстанавливался лучше [11].

У больных, перенёсших острый инсульт, концентрация вкДНК в плазме крови, измеренная в течении 24 часов, коррелирует с тяжестью инсульта и может служить предиктором смертности и тяжести исхода даже у тех пациентов, у которых нет видимых изменений, обнаруживаемых методами нейровизуализации [12,13].

Известно, что для вкДНК характерно наличие большое количества гуанин-цитозин (ГЦ)-последовательностей, которые более устойчивы к разрушению нуклеазами, чем аденин-тимин-фрагменты ДНК. Так, содержание специфической ГЦ-обогащенной последовательности генома - транскрибируемой области рибосомного повтора - в составе вкДНК в несколько раз превышает содержание этого повтора в ядерной ДНК [14].

А при хронических патологиях, сопровождающихся активацией клеточной гибели (ишемической болезни сердца, артериальной гипертонии, аутоиммунных патологиях), содержание этих ГЦ-богатых маркерных последовательностей в вкДНК крови увеличивается в 10 и более раз [15]. Это даёт полную возможность использовать показатели ГЦ-обогащённой рибосомной ДНК в составе вкДНК в качестве биомаркера хронически протекающего патологического процесса.

При борьбе с раком стоит задача обнаружить опухоль на максимально ранней стадии. Тут вкДНК представляет крайний интерес, как биомаркер опухолегенеза.

Точечные мутации в опухолевой вкДНК обнаруживались в крови пациентов задолго до постановки диагноза[16].

Про уровни вкДНК при онкологии, поиску в составе вкДНК характерных для канцерогенеза мутаций, таких, как онкогены KRAS, HER2, BRCA1, APC, PIK3CA, BRAF и др., использованию в качестве маркера митохондриальной ДНК в составе вкДНК, изучению характерных генетических и эпигенетических изменений вкДНК, таких, как гипометилирование подвижных элементов Alu, при возникновении опухолей, использования «индекса целостности» вкДНК и прочих аспектов можно прочесть в работах Васильевой и соавт., Gonzalez-Masia и соавт. [17, 18].

Установлено, что для вкДНК характерно гораздо более сильная степень окисления под воздействием активных форм кислорода (АФК), чем для ядерной ДНК.

Так, содержание хорошо известного маркера окисления ДНК, 8-охоdG, в составе ядерной ДНК в норме и при различных патологиях колеблется от 1 до 10 на миллион нуклеотидов, а в составе вкДНК содержание этого маркера составляет 300 и более на миллион нуклеотидов [19].

Резкое повышение содержания 8-охоdG во вкДНК установлено при онкологии и сердечно-сосудистых заболеваниях, которые сопровождаются окислительным стрессом, и может достигать значений в 3000 8-oxodG на миллион нуклеотидов [20].

В целом, считается, что уровни 8-охоdG в составе вкДНК представляют собой чувствительный маркер общего окислительного стресса в организме.

Рис. 2. Циркулирующая внеклеточная ДНК - маркер при различных патологических состояниях, сопровождающихся повышенной гибелью клеток.

Внеклеточная ДНК как мобильный элемент

Большой и очень важный прорыв в исследованиях роли вкДНК во внутренних процессах произошёл 3 года назад. В 2015 году группой исследователей было сделано захватывающее открытие, показавшее, что вкДНК, подобно мобильным генетическим элементам, способна внедряться в ядерную ДНК и вызывать мутации в геноме [21]. Всё это очень удивительно.

В более ранних работах уже было показано, что опухолевая ДНК из крови может иметь способность встраиваться в ядерную ДНК. Мышиные фибробласты помещали в плазму, взятую у пациентов с раком толстой кишки, после чего в ДНК клеток мыши обнаруживались онкогены K-ras и гены белка р53, участвующего в апоптозе, а сами клетки были онкогенно трансформированы (при введении здоровым мышам вызывали рак) [22]. Что свидетельствует о том, что ДНК из плазмы была поглощена и интегрирована помещёнными в неё клетками. Это предполагаемое явление - поглощение здоровыми клетками онкогенов из циркулирующей в крови вкДНК - может быть ответственно за процесс метастазирования и получило название «генометастаз».

В другой работе были предоставлены данные о поглощении и интеграции фрагментов гена DYS14, специфичного для Y-хромосомы, в мозге женщины, вынашивавшей плод мужского пола [23].

В исследовании 2015 года учёные проследили, как флуоресцентно меченые вкДНК, взятые у больных раком и здоровых людей, без проблем встраивались в ядерную ДНК мышиных фибробластов в опытах in vitro (т.е вне живого организма, в клеточных культурах). Причём, человеческая вкДНК локализовалась в ядрах мышиных клеток в течение нескольких минут, и почти 100% ядер клеток мыши показывали флуоресцентные сигналы в течение 30 минут.

Секвенирование всего генома мышиных клеток показало присутствие в нём фрагментов ДНК человека, включая характерные мобильные элементы Alu. Кроме этого, авторы обнаружили индукцию γ-H2AX-очагов, возникающих при повреждении ДНК, а также повышение активности каспазы-3 и экспрессии генов ATM, p53, p21, GADD-34 и ДНК-лигазы. Что всё вместе свидетельствует о повышенной нестабильности генома, активации реакции ответа на повреждения ДНК и апоптоза.

Затем авторы проверили действие чужеродной вкДНК in vivo, на живом организме. Мышам внутривенно вводили человеческую вкДНК, фрагменты которой затем обнаружили в сердце, легких, печени и мозге мышей, умерщвленных через 7 дней после инъекции.

Причём, ведённые мышам частицы человеческой ДНК оказались способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в мозг. Как и в случае с клетками в культуре, внутривенное введение вкДНК вызывало индукцию γ-H2AX, проапоптотической каспазы-3 и активацию ответа на повреждения ДНК. И именно ответ на повреждение ДНК, по мнению учёных, играет центральную роль интеграции вкДНК в ядерную.

Ядерная ДНК воспринимает внедрение внеклеточной как двухцепочечный разрыв и начинает «латание» самой себя, встраивая циркулирующую ДНК в свой состав: «Активирование ответа на повреждение ДНК объединяет несколько разнородных вкДНК и фрагментированный хроматин в длинные конкатемеры посредством негомологичного соединения концов в рамках процесса восстановления».

В итоге авторы приходят к парадоксальному выводу: «Будучи повсеместным и постоянно возникающим, повреждение ядерной ДНК, вызванное внеклеточной циркулирующей ДНК, может быть основной причиной старения, связанных со старением отклонений и окончательной гибели организма. Таким образом, ДНК, возможно, играет парадоксальную роль как хранителя основ жизни, так и разрушителя самой жизни».

Надо ли говорить, что этот вывод очень сильно противоречит всем представлениям о старении на сегодняшний день.

Логика подсказывает, что этой гипотезе соответствовала бы следующая зависимость: чем больше продолжительность жизни вида, тем меньше у особи этой формы ДНК и/или она для данного вида менее опасна.

Но до тех пор, пока такое сравнительное исследование не выполнено, остается полагать, что у долгоживущего вида (человек) и короткоживущего (мышь) вкДНК производятся, предположительно, в относительно сравнимых количествах. И обнаружение повышенных концентраций этих молекул у пожилых вполне может быть, наоборот, следствием процесса старения, а не его причиной.

Хотя это такое следствие, которое может усиливать причину. Читай статью Беликова.

Кроме этого, авторы открытия предлагают отнести вкДНК к ещё одному классу мобильных генетических элементов. И тогда, возможно, получит своё объяснение широкое участие в эволюции такого процесса, как горизонтальный перенос генов, как у беспозвоночных, так и позвоночных представителей животного мира. Благодаря которому, по одним из последних данных, геном человека мог заимствовать у других видов несколько десятков генов [24]

Остаётся открытым очень важный вопрос: как именно вкДНК попадают в клетку? Имеющиеся гипотезы включают предположения, что частицы, содержащие ДНК, могут проникать в клетки через имеющиеся в мембране поры, а также посредством разных типов эндоцитоза, протеогликан-зависимого макропиноцитоза или при взаимодействии с мембранными белками.

Внеклеточная ДНК при ожирении, воспалении, рентгеновском облучении и стрессе различной природы

Ещё одно интересное открытие было сделано год спустя японскими исследователями. Они смогли описать активное участие вкДНК, появившейся в крови в результате гибели адипоцитов у людей с ожирением, в развитии воспаления и резистентности к инсулину. Ключевым фактором, взаимодействующим в этих процессах с вкДНК, была молекула врождённого иммунитета Toll-подобный рецептор 9 (TLR9) [25].

Не обошлось и без интриги со стороны российских учёных из Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Они установили, что рентгеновское облучение и антидиабетический препарат метформин вызывают увеличение выведения с мочой вкДНК (ядерной и митохондриальной) у крыс.

Их данные показали, что до опытов количество ядерной вкДНК было на 40% выше, а митохондриальной вкДНК - на 50% выше в моче пожилых крыс по сравнению с молодыми.

Через 12 часов после облучения содержание я-вкДНК и мт-вкДНК в моче молодых крыс увеличилось на 200% и 460% соответственно по сравнению с контролем, тогда как в моче пожилых крыс оно повысилось на 250% и 720%.

Через 6 часов после введения метформина другим крысам, количество я-вкДНК и мт-вкДНК в моче молодых крыс было повышено на 25% и 55% и на 50% и 160% в моче пожилых крыс.

По мнению авторов, эти данные говорят о том, что рентгеновские лучи и метформин вызывают значительное увеличение вкДНК в моче крыс (особенно старых), вызванное активной гибелью клеток в тканях. Эти результаты также позволяют предположить, что метформин, возможно, действует как сенолитик, инициируя гибель старых клеток, содержащих структурные и функциональные нарушения [26].

В октябре прошлого года, учёные проследили взаимосвязь уровней вкДНК с психическим стрессом и физическими нагрузками у молодых людей в возрасте 18-36 лет. Результаты показали двукратное увеличение вкДНК после острого психосоциального лабораторного стресса (TSST) и пятикратное увеличение вкДНК после упражнений на беговой дорожке (с достижением истощения сил бегущего).

Было также зафиксировано повышенное количество более коротких фрагментов вкДНК, характерное для апоптоза, в крови после физического истощения.

Внеклеточная митохондриальная ДНК показала одинаковое увеличение после обеих стрессовых нагрузок. Кроме этого, профили метилирования вкДНК, используемые в этой работе в качестве маркера для различного клеточного происхождения, значительно различались для разных стресс-тестов.

Для анализа метилирования учёными был выбран активно участвующий в эмбриональном развитии ген HOXA5 из-за специфичности его метилирования в разных типах клеток. Так, для него характерно гиперметилирование в мышечных клетках, гипометилирование в клетках мозга, из клеточных линий гиппокампа и культивируемых нейронов, и дифференциальное метилирование в клетках крови.

Метилирование гена HOXA5 во вкДНК понижалось сразу после психосоциального стресса и увеличивалось после физического стресса, что, по мнению авторов, указывает на различные клеточные источники активного высвобождения ядерной ДНК. [27].

Внеклеточная ДНК и старение

Теперь главное. Рассмотрим взаимосвязь уровней и специфических особенностей вкДНК со старением.

Первые работы, показавшие такую взаимосвязь, были опубликованы в 2011-13 годах. Финские микробиологи и иммунологи из университета Тампере изучили показатели вкДНК у долгожителей старше 90 лет, участников исследования Vitality 90+, и у молодых людей (в возрасте 22-37 лет) в качестве контрольной группы.

Результаты их работ показали, что концентрация вкДНК у долгожителей была значительно выше, чем у молодых. Также были характерные различия вкДНК: у старых людей она была представлена больше низкомолекулярными фрагментами, у молодых - больше высокомолекулярными, то есть более длинными.

В следующих работах эта же группа показала, что уровни вкДНК имели чёткую взаимосвязь с маркерами воспаления (положительно коррелировали с уровнем С-реактивного белка, сывороточного амилоида А (SAA) и др.) и смертностью у людей старше 90 лет. А также то, что более высокие уровни общей и гипометилированной вкДНК были связаны с системным воспалением и развитием старческой астении (frailty) [28-30].

Два самых свежих последних прошлогодних исследования по вкДНК и старению показали характерные эпигенетические изменения этой ДНК.

В одном из них команда учёных проанализировала, как с возрастом изменяется метилирование мобильных генетических элементов LINE-1 и Alu во вкДНК здоровых людей, в возрасте от 23 до 61 года.

Элемент LINE-1 имеет длину около 6 тыс.п.н., тогда как высокомолекулярные фрагменты вкДНК, для сравнения, имеют размер более 10 тыс.п.н.

LINE-1 относится к ретроэлементам, т.е. к мобильным элементам, которые для своего размножения используют обратную транскрипцию, перенос генетической информации с РНК на ДНК. LINE-1 - единственный известный на сегодня мобильный элемент генома, который сохраняет способность к размножению и перемещению своих копий в геноме. Также, это самый многочисленный из подвижных структур человека: копии LINE-1 занимают в ДНК огромную долю - пятую часть всего генома.

Второй элемент, Alu, не может самостоятельно размножаться и делать новые вставки в геном и зависит в этом процессе от генетического аппарата элемента LINE-1 (подробнее о ретроэлементах генома см. статью в Популярной Механике "Ретровирусы: «пятая колонна» ДНК").

Результаты исследования показали, что по мере старения происходит значительное уменьшение метилирования ретроэлементов LINE-1 и Alu, причём этот процесс заметно интенсивнее проходил у курильщиков.

Как сегодня установлено, активность элементов LINE-1 и Alu, которые способны вставлять свои копии в геном, вносят вклад в значительную часть генетических заболеваний человека и рака. Известно о более 100 опосредованных LINE-1 инсерциях (вставках), которые приводят к генетическим заболеваниям человека, и найдено несколько вставок LINE-1, которые прерывают гены-супрессоры опухолей и провоцируют рак [31].

Во втором исследовании учёные подтвердили снижение с возрастом метилирования элементов LINE-1 и Alu в составе вкДНК. Причём, среди 4 групп в исследовании (здоровые долгожители старше 100, нездоровые долгожители старше 100 лет, пожилые люди (71 год) и молодые люди (25 лет)) схожие характеристики вкДНК имели здоровые долгожители с молодыми людьми и пожилые люди с нездоровыми долгожителями:

«Постоянно в нашем исследовании мы отмечали большее сходство в профилях вкДНК, как глобально, так и локально между молодыми и здоровыми долгожителями, в отличие от пожилых людей и нездоровых долгожителей. Следовательно, наше исследование предполагает, что профилирование вкДНК может быть использовано не только в качестве биомаркера возраста, но и в качестве предиктора общего состояния здоровья». [32].

Таким образом, внеклеточная циркулирующая ДНК оказалась тесно связана с состоянием здоровья и процессами, происходящими в организме в ходе старения: окислительным стрессом, воспалением и возрастзависимыми патологиями.

Современные методы исследования, такие, как количественная ПЦР в реальном времени, позволяют использовать вкДНК в качестве очень чувствительного биомаркера процессов, связанных со старением.

Проведённые исследования показали большую потенциальную ценность анализа вкДНК в диагностике рака, в траспланталогии, при сердечно-сосудистых заболеваниях и болезнях почек, фиброзе, в пренатальной диагностике (во время беременности), при травмах и сепсисе, а также в спортивной медицине.

Полученные данные о том, что вкДНК может проявлять свойства мобильного элемента и встраиваться в ядерную ДНК, тем самым влияя на развитие связанных с мутациями патологий и старением в целом, также представляют несомненный интерес.

Всё это требует дальнейших исследований и уточнений.

Обзор подготовили: Алексей Ржешевский и немного Михаил Батин