«СИРОТСКОМУ» РЕЦЕПТОРУ НАШЛИ «ПАПАШУ»

Не зря древние греки говорили, что человек - это микрокосм. Наше тело, наравне с другими живыми организмами, хранит не меньше загадок, чем далёкие окраины Вселенной. Об одной такой загадке, к пониманию которой приблизились российские учёные, STRF.ru рассказал руководитель лаборатории клеточной биологии рецепторов Института биоорганической химии РАН, доктор химических наук Александр Петренко. Речь идет о рецепторах, которые могут быть связаны с разными состояниями организма - это и почечная недостаточность, и ожирение и беспричинная агрессия. А реагируют они на неожиданный раздражитель - повышение рН в организме.

Связать биологически активную молекулу с конкретным рецептором не всегда просто. Например, гормон инсулин, отвечающий за содержание сахара в крови, был открыт около ста лет назад. А белок-рецептор, реагирующий на изменение концентрации этого гормона и вызывающий так называемый «клеточный ответ», был найден и исследован только более чем полвека спустя. Причём эта работа до конца не завершена.

Сразу после открытия рецептора инсулина был обнаружен два подобных ему белка, все вместе они получили название «мини-семейство рецептора инсулина». Последним из них был открыт рецептор, который по структуре был схож с рецепторами инсулина, но на сам гормон никак не реагирует. Именно его исследованием занимается научная группа Александра Петренко.

Александр Георгиевич, расскажите о рецепторе, который Вы исследуете.

- Этот рецептор был найден вследствие его структурной схожести с рецепторами инсулина. Но он никак не реагировал, ни на инсулин, ни на похожие гормоны, такие как инсулинподобный фактор роста. По сути, этот рецептор представлял собой то, что в научном мире называется «сиротский рецептор», то есть, не был известен его активатор, или как его называют по-научному, лиганд. И вследствие этого он получил название «рецептора, подобного рецептору инсулина». По-английски это звучит, как insulin related receptor, или в латинской аббревиатуре - IRR, соответственно, в русскоязычной аудитории мы его называем ИРР.

Рецепторы, входящие в мини-семейство рецептора инсулина. Дружеский шарж

Возможно, результатом нашего открытия явится появление нового имени у этого рецептора, а именно - «рецептор щёлочи» или «щелочной сенсор». Но пока этого ещё не произошло, и мы придерживаемся старой аббревиатуры ИРР.

В чём суть вашей работы? Какова была изначальная цель?

- Изначальная цель была - найти природный лиганд ИРР. Нужно сказать, что эта задача очень интересная, поскольку изначально предполагалось, что это будет белок, чем-то похожий на важный гормон инсулин. Предварительные эксперименты позволили нам найти - достаточно случайным образом - условия, в которых этот белок мог активироваться.

В течение двух лет мы пытались выделить некую субстанцию, которая всё время исчезала, проходила у нас между пальцами. Оказалось, что суть наблюдаемой активации заключается в изменении pH.

Когда люди работают с клетками, они всегда работают, грубо говоря, при нейтральном pH. И никому в голову не придёт проводить какие-то эксперименты при pH других величин. А у нас это просто получилось случайно, и мы наблюдали реакцию рецептора.

Потом, когда мы стали анализировать произошедшее, мы поняли, что вносится некая вариабельность за счёт того, что во внешней среде изменяется концентрация углекислого газа. И этого может быть достаточно для того, чтобы изменить pH в слабощелочную сторону, и при этом активировать рецептор.

Для того чтобы понять, что за этим стоит, нами было поставлено две цели. Первая цель - изучить явление активации с точки зрения науки о рецепторах. То есть, соответствует ли это явление тому, что мы бы ожидали от другого рецептора, такого как рецептор инсулина? И вторая - это уже in vivo, в животных, спланировать и провести эксперименты, которые могли бы нам либо подтвердить, либо опровергнуть эту гипотезу.

На первом этапе этой работы мы провели эксперименты in vitro, исследовали рецепторы биохимическими способами и методами клеточной биологии. Мы показали, что взаимодействие гидроксил-аниона с ИРР ничем не отличается от взаимодействия инсулина с рецептором инсулина по многим характеристикам. И самое важное, мы показали, что это специфическое свойство данного рецептора, а не какая-то «шутка природы».

Дальше проводились эксперименты на животных и нам удалось, показать, во-первых, что этот рецептор может активироваться в условиях in vivo, «в живом животном», а во-вторых, что если мы создадим животное, у которого нет этого рецептора, то у него будет наблюдаться дефект в регуляции кислотно-щелочного равновесия.

Расскажите, пожалуйста, подробнее о самих экспериментах.

- Мы сделали два ключевых эксперимента. В рамках первого мы переводили животное в искусственное щелочное состояние инъекцией бикарбоната натрия. И добились того, что почки стали выделять мочу с pH больше 8, а когда мы эти почки удалили, то показали, что в них действительно находится активированный рецептор ИРР.

А второй эксперимент был следующий: мы получили линию мышек, в которых генетическим образом был удалён ИРР. Интересно, что эти мышки - в отличие от мышей без рецептора инсулина или инсулиноподобного ростового фактора, в целом хорошо себя чувствуют при комфортных условиях (когда за бортом 25 градусов, их кормят стандартной пищей, у них стандартная физическая активность и т.д.).

Мы этих мышей подвергли щелочной нагрузке и заметили отличия их регуляторных процессов от здоровых мышей. У здоровых мышей, при попадании в организм даже небольшого избытка щёлочи, моментально реагируют почки, они выбрасывают избыток щёлочи из организма. Этот быстрый процесс, нормальный и естественный, приводит к тому, что сохраняется постоянство pH в крови и соотношение бикарбоната и углекислого газа. А у мышей без ИРР избыточая щелочь в виде бикарбоната почками не выводится. pH крови при этом поначалу немного сдвигается в щелочную область за счет увеличения концентрациии бикарбоната, а затем у них начинает накапливаться в крови углекислота, компенсируя таким образом увеличение бикарбоната. И pH сохраняется в районе нейтрального.

Естественно, это «неправильный» способ, своего рода защитный механизм. Накопление у мышей углекислого газа происходит за счёт того, что у животных нарушается дыхание, они меньше дышат. Соответственно, у них меньше кислорода поступает в организм, и это определённым образом сказывается на состоянии сердечнососудистой системы.

С экспериментом по удалению почками бикарбоната нам помогли коллеги из Франции. Одной из ключевых проблем для нас было определение концентрации бикарбоната в моче, это ни мы, ни кто-либо в России вообще не могли делать аккуратно. И мы вышли на лучшего в мире специалиста в этой области. Мы приехали в его лабораторию с мышами, и практически за 20 дней вся работа была сделана. Фактически, мы использовали чужую экспертизу, чужие навыки, оборудование и т.д. Но концептуально это наша работа.

А насколько вообще важен кислотно-щелочной баланс в организме? И как можно на него повлиять?

- На сегодняшний день это не такая популярная тема, как регуляция концентрации глюкозы, но я уверен, что рано или поздно мы к этому приблизимся. В Америке неким эмпирическим путём была разработана диета, которая регулирует кислотно-щелочное равновесие в организме. Прежде всего она базируется на принципах вегетарианского питания. И её применение позволяет успешно лечить ряд заболеваний - самое удивительное, что даже рак. Это, конечно, не панацея, но в отдельных случаях работает! Я об этой диете узнал от одного американского врача. Когда я ему рассказал о своей работе, он говорит: «О, а у меня была пациентка, которая умирала от рака. Она съездила, провела курс этой терапии щелочной диетой, и вот до сих пор жива».

Но, к сожалению, те люди, которые это нащупали и развили, больше коммерсанты, чем учёные. Они создали санаторий и там делают деньги, но при этом им не интересно, почему это так происходит. И в связи с этим понятно, что мы ещё многого не понимаем о важности регуляции кислотно-щелочного равновесия.

Медики, которые изучали поддержание кислотно-щелочного равновесия - в основном врачи-реаниматологи. Почему? Потому что так же, как сдвиг концентрации глюкозы как вниз, так и наверх приводит к состояниям, угрожающим жизни, так и сдвиг кислотно-щелочного равновесия опасен для жизни. Причём на сегодняшний день нет простых способов его корректировать, кроме целенаправленного впрыскивания в кровь щёлочи или кислоты, и этим в частности занимаются реаниматологи.

Условно-нейтральная величина pH в крови человека, это 7,4. И есть некий узкий диапазон pH в котором человек относительно нормально себя чувствует.

В слабокислую сторону pH довольно легко может сдвигаться вследствие различных факторов, например питания, что приводит к болезненному сотоянию. В то время как сдвиг рН крови в щелочную область - это смертельное состояние. И это состояние надо корректировать, что называется, «здесь и сейчас».

Здесь есть определенное сходство с сахарными состояниями. Когда у нас избыток сахара - это заведомо патологическое состояние, которое приводит ко всем негативным последствиям диабета. А пониженный сахар - это гипогликемия, человек слабенький, плохо себя чувствует, но ничего катастрофического не происходит. Я думаю, что здесь примерно та же ситуация.

А есть ли принципиальные отличия в функции рецепторов инсулина и ИРР?

- Рецептор инсулина есть почти во всех тканях и почти во всех клетках, но в разных количествах. А рецептор ИРР, как оказалось, есть далеко не везде.

На сегодняшний день чётко доказано, что ИРР есть в четырёх органах: больше всего его находится в почках, чуть меньше - в поджелудочной железе и в желудке. Совсем мало - в нервной системе.

Если мы просто посмотрим на спектр этих тканей, то становится понятно, что этот белок действительно должен быть каким-то образом связан с регуляцией кислотно-щелочного равновесия. Потому что именно в этих органах pH внеклеточных жидкостей может существенно меняться, как в кислую, так и в щелочную сторону.

Например, почки являются одним из двух главных органов, регулирующих кислотно-щелочной баланс в организме наряду с лёгкими. Лёгкие удаляют углекислый газ, то есть, выбрасывают избыточную кислоту. А почки могут выбрасывать как избыточную кислоту, если лёгкие этого не делают полностью в силу каких-то причин, так и избыток щёлочи. В моче pH может меняться в гигантском диапазоне от 4 чуть ли не до 9. И в этих органах действительно должны находиться такие белки, которые ощущают скачки pH.

Похожая ситуация в поджелудочной железе и в желудке. Одна из основных функций поджелудочной железы в том, что она выделяет поджелудочный сок, который попадает в кишечник. Этот сок доставляет туда, во-первых, ферменты, а во-вторых, щёлочь в виде бикарбоната, которая нейтрализует кислоту, поступающую из желудка вместе с пищей. То есть, pH этого поджелудочного сока слабощелочной.

В желудке происходит выделение кислоты (pH там порядка 2). Но, естественно, по законам сохранения, если куда-то выделилась кислота, то где-то должна остаться щёлочь. И она накапливается в стенках желудка, в особом слое, который защищает стенки желудка от сильной кислоты. А избыток щёлочи, который компенсирует выход большого количества кислоты, удаляется кровью. В тех клетках, где происходит накопление щёлочи, и был обнаружен ИРР.

А вот что может он делать в мозгу? Это настолько интересная тема, что на неё мы получили грант РНФ. И пытаемся разобраться, что же этот белок может делать в нервной системе in vivo.

Ранее, к примеру, в нервных клетках были обнаружены рецепторы, которые чувствуют изменения pH в кислой области. Интересно, что они работают, как сенсоры боли и различных физических воздействий. То есть, возможно, щёлочь тоже является индикатором каких-то процессов, о которых мы пока не знаем.

Ещё один важный аспект наших исследований связан с тем, что ИРР по сути своей является структурным братом рецептора инсулина. Поэтому исследуя структуру ИРР и его превращения при активации, мы, возможно, приблизимся к пониманию того, как работает рецептор инсулина.

Как именно исследования структуры ИРР поможет понять механизм работы инсулина?

- Мы проводили работы по направленному мутагенезу ИРР и смотрели, каким образом меняется его чувствительность к pH. Впоследней статье, которую мы опубликовали, мы сформулировали концепцию, что есть 2 основных центра pH-чувствительности. Причём ответ в одном центре увеличивает вероятность ответа в другом. И вот мы пришли к модели, которая похожа на ножницы, имеет «лямбда-форму» (по-русски это буква Л).

Модель активации рецептора ИРР под действием щелочного рН

Представьте, что у этой буквы Л ножки начнут слипаться. Если есть два разнесённых центра, один чуть ближе к верхушке, а другой - чуть дальше, то если прошло сближение наверху, то облегчается сближение внизу. И за счёт этого достигается положительная кооперативность.

Потом с помощью методов биоинформатики и компьютерного моделирования мы постарались найти те аминокислоты, которые могут непосредственно участвовать в активации. В общем, сейчас у нас есть некое общее представление о происходящих при этом процессах. И мы продолжаем работать в нескольких направлениях по изучению трёхмерной структуры ИРР и её изменении при активации рецептора.

Расскажите, пожалуйста, о дальнейшем ходе исследований.

- Мы будем продолжать исследования, причём как in vitro, так и in vivo. Второе направление поставило перед нами несколько интересных задач.

Например, мы обнаружили, что у линии мышей без рецептора ИРР повышенный вес. Вскрытие показало, что у них более интенсивно накапливается жир. Этот эффект мы сейчас проверяем. Пытаемся понять, это какая-то случайно накопленная мутация у нашей линии мышей, или это действительно следствие того, что мы убрали ИРР.

Собственно, за накопление жира в организме отвечает рецептор инсулина. Центральная функция инсулина - регулировка даже не уровня углеводов, а метаболизма жиров. Просто считается, что люди от ожирения не умирают, а от вторичных последствий повышения глюкозы умереть вполне могут. Но сейчас всё больше и больше уделяется внимание и второй функции. В дальнейшем мы можем проводить эксперименты, чтобы попытаться найти пути, где перекрещивается работа рецептора инсулина и ИРР.

Ещё одно интересное свойство этих мышей обнаружили ветеринары, которые за ними ухаживают и непосредственно находятся в питомнике. Они сказали, что наши мышки безумно агрессивные. До такой степени, что если в одной клетке оставить двух зверьков на ночь, то утром в лучшем случае там не будет одного. Они будут грызть друг друга до смертельного исхода.

Недавно мы нашли физиологов в России, которые занимаются анализом подобных состояний. Мы поставили перед ними задачу - провести, научно правильное, стандартизированное исследование. Подтвердится или не подтвердится наше наблюдение - загадывать сложно. Но это интересное направление, которое может быть косвенным образом связано с наличием ИРР в мозгу.

Это наши первые кирпичики во всё «здание» понимания регуляции кислотно-щелочного баланса.

Иллюстрации предоставлены научным коллективом А.Г.Петренко