Могут ли карнозин и его аналоги замедлить старение кожи?

АНАТОЛИЙ ДЕЕВ,

Российский Государственный Медицинский Университет, Москва

МАРК БАБИЖАЕВ,

Innovative Vision Products, Inc.,USA

            Информация об авторах: Деев Анатолий Иванович, кандидат биологических наук, доцент кафедр биофизики (Российский государственный медицинский университет) и кафедры психологии раннего детства (Московский городской психолого-педагогический университет).

            Область профессиональных интересов: медицинская биофизика, геронтология, возрастная физиология.

Информация об авторах: Бабижаев Марк Аркадьевич, кандидат биологических наук, исполнительный директор фирмы Innovative Vision Products (США).

            Область профессиональных интересов: применение биологически активных пептидов в офтальмологии и косметологии.

Can carnosine and its analogues delay the skin aging?

ANATOLY IVANOVICH DEYEV

Russian State Medical University, Moscow

MARK ARKAD’EVICH BABIZHAYEV

Innovative Vision Products, Delaware USA

The carnosine and carnosine related compounds are well-known dipeptide consisting of β-alanine and histidine. It is normally made in the human body and found at high level in brain the eye of the lens, and skeletal muscle tissue. In laboratory studies, it has been demonstrated that carnosine has the ability to protect cells against oxidative stress as well as to increase their resistance toward functional exhaustion and accumulation of senile features. Physiological concentration of carnosine  (20-30 mM) in standard media prolong the in-vitro life span of human fibroblast cells and strongly reduce the normal features of senescence. Carnosine has the remarkable ability to rejuvenate cells approaching senescence. Studies show that carnosine is effective against such forms of protein modification as oxidation, carbonylation, cross-linking, glycation and advanced glycation endproduct formation. The aging processes - cellular senescence, protein carbonylation and proteasomal decline - play leading roles in the changes that aging brings to the skin. Carnosine is the only agent that has shown multi-modal protective effects against protein degradation and cellular senescence .

Карнозин и родственные ему соединения являются хорошо известными дипептидами, состоящими из β-аланина и гистидина. Они синтезируются в норме в теле человека и содержатся в высокой концентрации в мозгу, хрусталике глаза и скелетной мускулатуре. В условиях эксперимента было показано, что карнозин обладает способностью защищать клетки против окислительного стресса, а также увеличивать их резистентность к функциональному истощению и накоплению возрастных изменений. Физиологические концентрации карнозина (20-30 мМ) в стандартных средах культуры клеток удлиняли  in  vitro  продолжительность жизни фибробластов человека и значительно снижали проявления старения клеток. Карнозин обладает замечательной способностью омоложения клеток, приближающихся к старению. Исследования показали, что карнозин эффективен против таких форм модификации белков как окисление, карбонилирование, образование поперечных сшивок, гликирование и образование конечных гликозилированных продуктов. Такие процессы, сопровождающие старение, как старение клеток, карбонилирование белков и снижение активности протеосом, играют ключевую роль в возрастных изменениях стареющей кожи. Карнозин обладает уникальным мультимодальным защитным эффектом против деградации белков и старения клеток.

Введение

Удивительному дипептиду карнозину пошел 104 год со дня открытия. Биохимики отметили столетний юбилей этого вещества, посвятив ему целый номер журнала «Биохимия» (2000г., т.65, №7) и обширную монографию «Карнозин» [1], геронтологи обнадёжили человечество тем, что N-ацетилкарнозин может задерживать развитие катаракты [2], косметологи обратили внимание на ранозаживляющие свойства карнозина [3]. Несмотря на почтенный возраст, удивительный дипептид не стареет и преподносит учёным новые загадки и сюрпризы. О новых аспектах физиологической активности карнозина и его производных важных для косметологии пойдет речь в данной статье.

Карнозин и его аналоги входят в большое семейство гистидинсодержащих дипептидов (ГСД). Полипотентность действия ГСД, проявляющаяся в многообразии их терапевтических эффектов, таких как противовоспалительный (лечение полиартритов, заживление кожных ран), бактериостатический, иммуномодулирующий (подавление анафилактической реакции), регуляторный (регуляция функции надпочечников, антистрессорное действие), антиоксидантный (радиозащитное действие, лечение катаракты) и других. Такой широкий диапазон действия ГСД позволяет считать, что эти соединения играют ключевую роль в управлении гомеостатическими процессами в организме [3].

Последние годы прошедшего тысячелетия ознаменовались новым всплеском интереса к ГСД в связи с их геропротекторными свойствами т.е. способностью задерживать старение, а точнее заметно усмирять разрушительную силу времени в отношении «кирпичиков» нашего организма белков, фосфолипидов и ДНК, а также построенных из них «блоков» - клеток.

Как и почему стареют клетки?

            Живые системы легко обводят время вокруг пальца с помощью деления. Казалось бы потенциал деления бесконечен, были бы в достаточном количестве энергия и стройматериалы для поддержания пластического обмена и, конечно, сохранялись бы неповрежденными «чертежи» нашего тела, записанные в коде ДНК. Однако примерно с тридцатилетнего возраста мы начинаем ощущать неумолимый ход часов жизни, проявляющейся в постепенной утрате функциональных способностей в среднем со скоростью 0,8% в год. Ещё в 1825 г. английский статистик Б. Гомперц обнаружил, что вероятность смерти человека после 30 лет удваивается каждые 8 лет. Что же вызывает этот естественный спад? Геронтологи предложили множество гипотез старения, акцентирующих внимание на различных аспектах этого многогранного процесса. Но главный парадокс старения состоял в том, что большинство клеток нашего организма, кроме нервных, некоторых мышечных и хрусталика, заменяются на протяжении жизни новыми. Однако постоянное обновление клеток не делает организм более молодым.

Разгадку этого парадокса предложил патриарх современной геронтологии Леонард Хейфлик, открывший предел деления клеточных линий, который впоследствии получил название «предел Хейфлика» [4,5]. На культуре фибробластов Л.Хейфлик и П.Мурхед показали существование предела продолжительности жизни, равное примерно 50-70 делениям. Клетки как-будто бы имели встроенные часы, которые отсчитывали деления. Ограниченная продолжительность жизни культивируемых клеток присуща не только фибробластам, но и клеткам других видов тканей, включая кожу, печень и гладкую мускулатуру. Л.Хейфлик предположил, что продолжительность роста клеточных линий вполне может соответствовать границе продолжительности жизни человека.

Гипотеза строения клеточных часов была предложена советским учёным А.М.Оловниковым и получила название «маргинотомии (от лат.  marginalis  - краевой,  tome  - сечение) [6]. Суть этой гипотезы состоит в том, что при каждом делении клетки её ДНК укорачивается на конце, это ограничивает пролиферативный потенциал клеток и, очевидно, является тем "счётчиком" числа делений и, соответственно продолжительности жизни клетки в культуре. Таким образом, отпущенная клетке продолжительность жизни отмеряется длиной концевого участка ДНК, получившего название теломеры. Открытие в 1985 г. теломеразы - фермента, который достраивал укороченную теломеру в половых клетках и клетках опухолей, обеспечивая их бессмертие, вдохнуло новую жизнь в гипотезу Оловникова.  Перед геронтологией встала новая проблема как сохранить, а может быть даже удлинить теломеру. Во многих лабораториях мира стали испытывать различные соединения в надежде, что существуют вещества способные продлить срок жизни клеток и задержать их старение, но удача улыбнулась австралийцам.

Пептид, продлевающий клетке жизнь

Около десяти лет назад был обнаружен удивительный омолаживающий эффект карнозина в культуре фибробластов [7, 8]. Обычно клетки на последних пассажах деления проявляют такие признаки старения как увеличение вариабельности по размеру и форме, повышение содержания гранул и вакуолей, потеря способности прикрепляться к подложке. Однако в присутствие карнозина (20-50 мМ) клетки выглядели молодыми даже на последних делениях. Более того, добавление карнозина к стареющим клеткам возвращало им молодость и нередко увеличивало их способность к делению. Перемещение клеток из среды с карнозином в среду без него приводило к быстрому появлению признаков старения клеток. Карнозин также увеличивал продолжительность жизни даже старых клеток и увеличивал предел Хейфлика. Так, например, перенос стареющих клеток (55 удвоений) в среду с карнозином увеличивал  число делений до 69-70, в то время как без карнозина клетки доживали до 57-61 деления. И если в обычной среде клетки переживали от 126 до 139 дней, то в среде с карнозином их продолжительность жизни увеличивалась до 413 дней. Таким образом, карнозин поддерживал и сохранял гомеостаз клеток почти до их смерти. Следует также отметить, что в вышеописанных опытах использовалась культура клеток человека и концентрации карнозина 20-50 мМ, близкие к физиологическим. Так в мышцах человека содержится около 20 мМ карнозина, а в мышцах мышей всего 1 мМ [8].

Увеличение продолжительности жизни клеток в культуре, обусловленное карнозином, по мнению авторов объясняется либо уменьшением длины теломерных фрагментов ДНК, теряемых клеткой при каждом удвоении, либо уменьшением скорости метилирования ДНК. Не исключено также, что карнозин снижает скорость накопления в ДНК каких-то иных изменений, накопление которых выше критической точки ведёт к прекращению делений [8].

Карнозин также значительно снижает повреждение хромосом в клетке. В условиях гипероксии (80-90% О₂) без карнозина на 100 клеток обнаруживалось 133 абберации, а в присутствии карнозина число аббераций сократилось до 44. Число интактных клеток в среде с карнозином составляло 68%, а без него - 44% [9].

Поразительной особенностью эффектов карнозина является его различное действие на нормальные и раковые клетки. В культуре раковых клеток карнозин проявлял токсический эффект, правда только в отсутствие пирувата, необходимого для запуска цикла Кребса и дыхания клеток. По-видимому, карнозин ингибирует бескислородный этап (гликолиз) получения энергии, который в раковых клетках намного более интенсивен, чем в нормальных [8].

Ревитализация клеток

Основная мечта косметологии - добиться омоложения стареющей кожи. В обыденном сознании укоренилось мнение, что реально омолодиться невозможно, ибо время необратимо, но создать иллюзию омоложения, «заштукатурив изъяны» можно. Отсюда и пошло несколько обидное для косметологов выражение - «косметический ремонт».

Добавление карнозина к стареющим клеткам приводило к исчезновению признаков, о которых было сказано выше, характерных для стареющей культуры клеток. Удаление карнозина из среды культивации быстро возвращало клетки на стезю обычного старения. Этот эффект перехода клеток во внешне более молодое состояние на английском языке был назван ревитализацией ( revitalizing   effects ). Карнозин является в культуре клеток как-бы переключателем пути развития: из старения к омоложению и наоборот [8].

Каковы же возможные механизмы такой ревитализации? Геропротекторные свойства ГСД могут объясняться несколькими процессами [1]. Во первых, ГСД могут выступать в качестве эффективных гидрофильных антиоксидантов, во-вторых они способны поддерживать на физиологическом уровне не только концентрацию водородных ионов, но также ионов меди, цинка и, что особенно важно, железа, уровень которого играет ключевую роль в протекании свободнорадикальных реакций. Особенностью β-аминогруппы карнозина является способность легко взаимодействовать с альдосахарами, конкурентно опережая тем самым в этой реакции ε-аминогруппы белковых лизинов. Иными словами, карнозин выполняет роль своеобразного громоотвода, принимающего атаку сахаров на белки на себя и защищающего белковые молекулы от гликирования. Реакция гликирования белков приводит, в частности, к образованию сшивок между коллагеновыми волокнами и потере эластичности кожи. Роль этих процессов в косметологии рассмотрена в обзоре А.А.Болдырева [3].

В последние годы появились предположения о способности карнозина соединяться с карбонильными группами белков [10]. Эти группы возникают в результате повреждения боковых аминогрупп белков альдегидами сахаров (гликирование) или альдегидами, возникающими в ходе протекания свободнорадикальных реакций, например, малоновым диальдегидом. Присоединение карнозина к белку через карбонильную группу т.е. карнозилирование белка даёт защитный эффект. Во-первых, блокировка карбонильной группы карнозином не позволяет этой группе взаимодействовать с аминогруппами нативных белков, вовлекая их тем самым в образование межбелковых сшивок. Во-вторых, карнозилированные белки подвергаются, по-видимому, удалению из клетки путём экзоцитоза. В дальнейшем эти белки с помощью специальных рецепторов могут захватываться другими клетками путём эндоцитоза и разрушаться в них.

Накопление белков с карбонильными группами ведёт к старению клеток и накоплению в них флуоресцирующего пигмента старения - липофусцина. Вероятно, именно этим объясняется увеличение собственной эпифлуоресценции кожи с началом её старения. А именно, у мужчин в возрастном диапазоне 20-50 лет интенсивность флуоресценции кожи на подушечках пальцев рук практически одинакова. Однако после 50 лет интенсивность флуоресценции начинает резко увеличиваться, троекратно возрастая к 70 годам [11].

Следует иметь в виду, что накопление повреждённых биомолекул отнюдь не безобидный инертный процесс захламления клетки. Существуют специальные рецепторы связывания подобных продуктов, причём заполнение этих рецепторов включает в клетках окислительный стресс, увеличивающий продукцию свободных радикалов примерно в 50 раз. Возникает положительная обратная связь между образованием повреждённых молекул и выработкой свободных радикалов, которая ведёт к распространению в тканях организма волн клеточной активизации с последующим повреждением тканей [12].

Возможно, чтобы избежать запуска цепных реакций подобных процессов в долгоживущих клетках нервов, мышц и хрусталика содержатся высокие концентрации карнозина. Каким же путём карнозин позволяет уменьшить накопление в тканях продуктов старения? Основным физиологическим механизмом удаления повреждённых белков клетки является их протеолиз в специальных белковых устройствах - протеосомах, разрушающих поврежденные белки до составляющих их олигомеров и мономеров. Однако с возрастом функциональная активность протеосом падает [13]. Как показано в опытах на культуре клеток карнозин усиливает протеолиз, причём особенно сильно в старых клетках и несколько меньше в стареющих, компенсируя тем самым снижение протеолитической активности клеток [10].

Важной функцией карнозина является его антигликирующая активность. Гликированные белки опасны не только сами по себе, но и тем, что способны формировать связи с нативными белками за счёт перекрестных сшивок. Так добавление гликированного альбумина к нативным белкам хрусталика - α-кристаллинам приводило к формированию сшивок между этими разнородными белками. Карнозин останавливал этот процесс [10].

Недавно обнаружился ещё один интересный аспект омолаживающего действия карнозина на клетки. В работах японских исследователей была показана способность карнозина к стимуляции образования виментина в культуре фибробластов [14]. Как известно, промежуточные филаменты - это прочные и относительно долговечные белковые фибриллы толщиной 8-10 нм. Эти структуры являются наиболее стойкими волокнами внутри клетки, формируя её каркас (цитоскелет). Они наиболее развиты в тех частях клетки, которые подвергаются механическим нагрузкам, и представляют собой самые стабильные компоненты цитоскелета. Стимуляция синтеза виментина придаёт клетке упругость и постоянство формы, характерные для молодой клетки.

От чего зависит концентрация карнозина в тканях?

Казалось бы, что столь замечательные свойства карнозина и других ГСД открывают им дорогу для самого широкого применения. Но следует обратить внимание на тот факт, что большинство геропротекторных и ревитализирующих свойств этих соединений обнаружены в культуре клеток, где концентрация пептида задаётся самим экспериментатором. В организме человека концентрация карнозина поддерживается за счёт работы соответствующих ферментов его метаболизма: синтезирующих этот пептид (карнозин синтетазы) и разрушающих его (тканевая и сывороточная карнозиназы). Сывороточная карнозиназа обнаружена только у высших приматов и некоторых хомяков [1].

Офтальмологи столкнулись с проблемой применения карнозина почти 15 лет назад. Ещё в 1987 г. карнозин был успешно применен для лечения катаракты у собак. Закапывание раствора карнозина уменьшало рассеивание света и увеличивало прозрачность хрусталика, т.е. фактически происходило обращение развития катаракты на начальных этапах [15]. Однако закапывание раствора карнозина в глаз человека, приводило к расщеплению пептида на β-аланин и гистидин, из которого может образовываться небезопасный гистамин -медиатор аллергических реакций.

«Обмануть» карнозиназу удалось, закрыв β-аминогруппу аланина ацетильной группировкой. Полученный таким образом N-ацетилкарнозин оказался устойчивым к действию сывороточной карнозиназы. Не узнанный этим ферментом, препарат проникает в клетки хрусталика, проявляя там свою активность. Как запатентованное средство [16], N-ацетилкарнозин начал применяться для лечения и обращение катаракт на ранних этапах их развития [17]. Возможно, что опыт применения модифицированных ГСД, минующих карнозиназный контроль, может найти своё применение и в косметологии.

Заключение

Такие процессы в клетке как карбонилирование белков, снижение активности протеосом играют ведущую роль и в старении кожи. Так в возрасте около 80 лет популяция фибробластов уменьшается наполовину, волокна коллагена становятся дезорганизованными и теряют протеогликаны. Карбонилирование белков охватывает как эпидермис, так и дерму. В результате этих процессов теряется эластичность кожи, появляются морщины, снижается способность ран к заживлению. Как уже было сказано, именно ГСД способны задерживать старение фибробластов, препятствовать карбонилированию белков и усиливать удаление поврежденных белков.

Характерным проявлением старения кожи является образование поперечных сшивок в коллагене. К сожалению ни антиоксиданты, ни хелаторы металлов не влияют на этот процесс. Пока антигликирующая активность, уменьшающая образование поперечных сшивок обнаружена у аминогуанидина, но подобным же действием обладают натуральные ГСД [18].

В свете вышеизложенного ГСД представляют собой перспективные для применения в косметологии соединения, имеющие выраженные геропротекторные свойства. Они могут найти применение в качестве гидрофильных антиоксидантов, антигликирующих средства, веществ нейтрализующих деструктивное действие свободнорадикальных процессов в коже.

Список литературы.

1. Болдырев А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. М: МГУ;1998.
2. Babizhayev M.A., Yermakova V.N., Deyev A.I., Seguin M-C. Imidazole-containing peptidomimetic NACA as a potent drug for the medicinal treatment of age-related cataract in humans. J Anti-Aging Medicine 2000; 31: 43-62.
3. Болдырев А.А. Карнозин и его ранозаживляющее действие. Косметика и медицина 1999;5-6:15-25.
4. Хейфлик Л. Клеточные основы старения человека. Молекулы и клетки. Вып.7. Под ред. Г.П.Георгиева, М: Мир; 1982. c.134-148.
5. Хейфлик Л. Как и почему мы стареем? М: ВЕЧЕ.АСТ; 1999.
6. Оловников А.М. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Докл. Акад. Наук 1971; 201:1496-9.
7. McFarland G.A., Holliday R. Retardation of the senescence of cultured human diploid fibroblasts by carnosine. Exp Cell Res. 1994 Jun; 212(2):167-75.
8. Holliday R., McFarland G.A. A Role for carnosine in cellular maintenance. Biochemistry (Mosc). 2000; Jul; 65(7):843-8.
9. Gille J.J., Pasman P., van Berkel G.G., Joenje H. Effect of antioxidants on hyperoxia-induced chromosomal breakage in Chinese hamster ovary cells: protection by carnosine. Mutagenesis 1991; 6(4): 313-8.
10. Hipkiss A.R. Carnosine and protein carbonyl groups: a possible relationship. Biochemistry (Mosc). 2000 Jul; 65(7):771-8.
11. Деев А.И., Кожухова Е.В., Тюрин-Кузьмин А.Ю., Владимиров Ю.А. Возрастная зависимость собственной флуоресценции кожи. Бюлл. экспер. биологии и медицины 1999; 127( 3): 351-3.
12. Schmidt A.M., Yan S.D., Yan S.F., Stern D.M. The biology of the receptor for advanced glycation end products and its ligands.Biochim Biophys Acta. 2000 Dec 20;1498(2-3):99-111.
13. Sitte N., Merker K., von Zglinicki T., Grune T. Proteinoxidation and degradation during proliferative senescence of human VRC-5 fibroblasts. Free Radic. Biol. Med. 2000;28(5):87-95.
14.  Ikeda D., Wada S., Tanaka H., Yoneda C, Abe H, Watabe S. Carnosine sustains the retention of cell morphology in continuous fibroblast culture subjected to nutrional insult. Biochem. Biophys. Comm. 1996;223(2):278-82.
15.  Babizhayev M.A. Antioxidant activity of L-carnosine, a natural histidine-containing dipeptide in crystalline lens.Biochem. Biophys. Acta 1989;1004:367-71.
16. Babizhayev M.A., Bozzo Costa E., Inventors; Pharmaceutical compositionscontaining N-acetylcarnosine for the treatment of cataract Italy Patent PCT/EP 94/03340 SCB 238 PCT, 1994 Octob 10.
17. Babizhayev M.A., Deyev A.I., Yermakova V.N., Semiletov Y.A., Davydova N.G., Kurysheva N.I., Zhukotskii A.V., Goldman I.M. N-Acetylcarnosine, a natural histidine-containing dipeptide, as a potent ophtalmic drug in treatment of human cataracts. Peptides 2001 Jun; 22(6): 979-94.
18. Hipkiss A.R.On the "struggle between chemistry and biology during aging"--implications for DNA repair, apoptosis and proteolysis, and a novel route of intervention. Biogerontology. 2001;2(3):173-8.