Применение стволовых клеток и фибробластов в клинике эстетической медицины

 Культивирование и трансплантация клеток и тканей фибробластов - область биомедицины, имеющая начало более века вспять, но получившая свое истинное развитие в последние 30-40 лет, когда появились методики, обусловившие возможность культивирования отдельных клеток. Сейчас существенное количество клеток, из 200 составляющих организм человека, удачно плодятся in vitro. В их число входят и фибробласты.

Следствием развития и совершенствования клеточной биологии явилось формирование нового направления клеточной и тканевой инженерии, относящегося к биомедицинской технологии, основанной на использовании культивированных клеток человека. Задачка этого направления - обеспечение замещения, восстановления покоробленных тканей за счет имплантации либо трансплантации выращенных in vitro клеток из здоровых тканей и органов. Возможность культивирования в достаточном объеме нужных для практики фибробластов делает реальным их внедрение в поликлинике. В Рф это направление получило развитие в ряде научных и практических учреждений: Институт цитологии РАН, Военно-медицинская академия МО РФ, Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, Институт кардиологии МЗ РФ, НИИ трансплантологии и искусственных органов, Институт Клеточных Технологий и др.
Фибробласты - главные клеточки соединительной ткани. Эти клеточки имеют мезенхимальное происхождение и морфологически характеризуются как клеточки круглой либо удлиненной, веретенообразной плоской формы с отростками и плоским округлым ядром. Фибробласты синтезируют тропоколлаген, предшественник коллагена, межклеточный матрикс и основное вещество соединительной ткани, бесформенное желе схожее вещество, заполняющее место меж клеточками и волокнами соединительной ткани. Участвуют в заживлении ран. В итоге дифференцирования фибробласты преобразуются в наименее активные зрелые клеточки - фиброциты.

Около 100 лет тому вспять в связи с развитием способов поддержания клеток in vitro со всей остротой встал вопрос о том, ограничен ли потенциал клеток многоклеточного организма. A.Каррель культивировал фибробласты сердца куриных зародышей в культуре в течение 34 лет, при всем этом клеточки прошли тыщи делений без конфигураций их морфологического строения либо скорости роста. Эти опыты повстречали суровые возражения. А именно, указывалось, что несовершенство способов культивирования приводило к внесению новых клеток в культуры при каждом их пересеве. С другой стороны, онкологам отлично известны бессчетные штаммы перевиваемых in vivo и in vitro опухолевых штаммов и линий, которые поддерживаются в течение многих лет, время от времени 10-ов лет, клеточки которых являются фактически бессмертными (иммортализированными). Вместе с этими опытами, появились наблюдения о том, что в клеточных культурах все таки не удается продолжительно поддерживать клеточки, приобретенные из обычных, не опухолевых тканей.

В 1961 г. L.Hayflick и P.S.Moorhead представили данные о том, что даже в безупречных критериях культивирования фибробласты зародыша человека способны делиться только ограниченное число раз (50 +/-10). Было установлено, что при самом кропотливом соблюдении всех мер предосторожности при пересевах клеточки проходят in vitro ряд полностью морфологически различимых стадий (фаз), после этого их способность к пролиферации исчерпывается и в таком состоянии способны находиться достаточно долгое время. В повторных опытах это наблюдение было неоднократно воспроизведено, последняя фаза жизни клеток в культуре была уподоблена клеточному старению, а сам парадокс получил по имени создателя заглавие лимита Хейфлика. Более того, оказалось, что с повышением возраста донора число делений, которые были способны совершить клеточки организма, значительно уменьшалось, что привело к представлению о существовании гипотетичного счетчика делений, ограничивающего общее их число.
После установления лимита Хейфлика и фактов, что обычные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют низкую экспрессию антигенов гистосовместимости и отсутствие онкогенных потенций, стало может быть внедрение культивируемых вне организма фибробластов человека для терапевтических целей. Исследования и клинические разработки в данном направлении протекают очень активно, что связано с общим подъемом клеточных технологий на базе стволовых клеток. 
Пробы использовать культивируемые вне организма фибробласты для терапевтических целей начали предприниматься скоро после установления фактов, что обычные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют ограниченную длительность жизни, низкую экспрессию антигенов гистосовместимости, отсутствие онкогенных потенций. Было показано, что пересаженные аллогенные фибробласты оказывают конкретное воздействие на заживление ран (Ross, 1968) и на эпителизацию (Coulomb et el, 1989). Появились данные, что фибробласты могут продуцировать коллагены I и II типов (Varga et al., 1987) и составляющие внеклеточного матрикса: ламинин, нидоген, тинасцин, хондроитин-4-сульфат, протеогликан (Halfter et al., 1990), фибронектин (Matsura, Hakamori, 1985), некие причины роста, также другие вещества.
В текущее время имеется существенное число работ, свидетельствующих о большой роли причин роста в эпителизации кожи. Причины роста - это регуляторные пептиды (тканевые гормоны), вырабатываемые клеточками разных типов, которые в значимой степени ускоряют регенераторный процесс. Многие причины роста продуцируются фибробластами:
1. Основной фактор роста фибробластов (bFGF) благоприятно влияет на рост всех типов клеток кожи, провоцирует продукцию компонент внеклеточного матрикса фибробластами (фибронектина и коллагена), провоцирует хемотаксис фибробластов и выработку ими новых волокон коллагена, эластина и фибронектина;
2. Трансформирующий ростовой фактор (TGF-бета) провоцирует хемотаксис фибробластов и продукцию ими коллагена и фибронектина (Капе С. et al., 1991).
3. Трансформирующий ростовой фактор (TGF-альфа) оказывает влияние на ангиогенез (Chen J., et al., 1993). Продуцируемые фибробластами причины роста могут ускорять восстановление пораженной дермы, что почти во всем разъясняет стимулирующее воздействие аллогенных клеток на заживление ран. 
4. Эпидермальный фактор роста (EGF)-усиливает пролиферацию и миграцию кератиноцитов; 
5. Фактор роста кератиноцитов (KGF)-усиливает заживление и эпителизацию ран; 
6. Трансформирующий фактор роста (a-NGF) интенсивно оказывает влияние на ангиогенез.
Не считая того, фибробласты продуцируют составляющие внеклеточного матрикса: нидоген, ламинин, тинасцин, хондроитин-4-сульфат, протеогликан.

В Институте хирургии им. А.В.Вишневского РАМН разработан и внедрен в клиническую практику новый способ исцеления широких ожоговых ран, принципно отличающийся от ранее предложенных, основанный на использовании культуры аллогенных фибробластов (Д.С.Саркисов, В.П.Туманов с соавт., 1990; В.Д.Федоров, Д.С.Саркисов с соавт., 1993; Д.С.Саркисов, А.А.Алексеев с соавт., 1994). Предпосылкой к его разработке стали предшествовавшие фундаментальные исследования регенераторного процесса, показавшие главную роль в нем фибробластов (В.В.Серов, А.Б.Шехтер, 1982; Е.А.Ефимов 1984; Л.И.Бобро 1990; B.Coulomb, L.Dubertret et. al., 1984; B.Coulomb, P.Satag, et al. 1986), также установившие факт частичной утраты фибробластами поверхностных антигенов гистосовместимости в процессе культивирования (P.Хэй 1989; J.Nanchahal, et al. 1989).

Патогенетический механизм деяния предложенного способа заключается в синтезе аллогенными фибробластами экстрацеллюлярного матрикса, причин роста, стимуляции пролиферации собственного эпителия, направленных на восстановление как эпидермального, так и дермального компонента кожи. При ожогах 3А степени и продолжительно незаживающих ранах трансплантацию 3-х дневной культуры аллофибробластов производят конкретно на приготовленные в итоге всеохватывающего исцеления раны. При глубочайших ожогах 3B, 4 степени трансплантацию аллофибробластов соединяют с аутодермопластикой с коэффициентом расширения 1:6 и поболее. В последнем случае аллофибробласты стимулируют эпителизацию ячеек аутотрансплантата.

Скопленный клинический опыт в разных ожоговых центрах и отделениях (А.А.Алексеев, А.Ю.Яшин 1996; А.А.Алексеев, Д.А.Саркисов с соавт., 1997; С.И.Воздвиженский, Л.И.Будкевич с соавт., 1996; Матчин Е.Н., Потапов В.Л., Огольцова В.А. 1996; Д.Я.Алейник, В.А.Аминев с соавт. 1998; Н.М.Кузнецов, О.Н.Мазка с соавт. 1998), показал его высшую эффективность. Преимуществами способа являются - маленькие сроки культивирования аллофибробластами (3 суток), не плохое приживление трансплантатов (в среднем 97 %), возможность сотворения банка аллогенных клеток, относительно маленькая себестоимость.
В детском ожоговом центре при ДГКБ № 9(А.К.Штукатуров; А.А. Бахарев, Г.З. Сайдгалин Н.А. Шмелева) раз в год проходит исцеление 370-420 малышей, пострадавших от ожогов. Из их у 130-150 малышей определяются глубочайшие и всераспространенные ожоги, у 35-40% которых для ускорения эпителизации может быть применение клеточных культур. Общая площадь глубочайшего поражения, требующего оперативного исцеления, у их составляет до 35-40 тыщ кв. см в год. При принятой методике предоперационной трансплантации аллофибробластов, в соотношении 30-60 тыс. клеток на см2 пораженной кожи, потребность в культуре фибробластов составит 1,2-2 миллиардов. клеток в год. При удачной разработке способа с внедрением эпителиальных клеточных пластов их потребность может составить до 45-50 тыс. кв. см в год. 
Аллофибробласты выращивались в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ. Пролечено 27 нездоровых с тепловыми поражениями 3-4 степени общей площадью поражения от 4 до 56%. Применение культуры аллофибробластов для предоперационной трансплантации на рану с целью ускорения эпителизации раны у нездоровых с глубокими ожогами оказалось оправданным. Культура аллофибробластов применялась или в виде взвеси, или на подложке на базе биосинтетического покрытия «Фолидерм».
Показаниями к использованию способа для исцеления глубочайших ожогов у малышей является наличие ожогов ЗА, 3В, и 4 степени более 10% площади тела, недостаток донорских ресурсов, продолжительно незаживающие гранулирующие раны. Абсолютных противопоказаний к использованию способа нет. Относительными противопоказаниями являются: общее очень тяжелое состояние хворого, недостаточно приготовленная рана с обсемененностью раны более 100 000 микробных тел на 1 гр. ткани, наличие грибковой флоры.

соединительной ткани. Иммунофлуоресцентная световая микроскопия указывает фибробласты кожи зародыша человека: клеточные ядра (голубые), цитоплазма (красноватая) - фибронектин, сеть коллагеновых волокон (зеленоватая).
Результаты внедрения способа в ДГКБ № 9 проявили высшую эффективность и экономическую необходимость внедрения данной технологии для исцеления томных нездоровых с тепловыми травмами.
В ближайшее время стали скапливаться данные о применении культивируемых in vitro фибробластов в стоматологии. О положительном эффекте исцеления пародонтита с внедрением культуры аллофибробластов, приобретенной из дермы плодов человека, не так давно заявили российские исследователи (В.П. Туманов с соавт., 1998 г.). Данными создателями был разработан новый метод исцеления воспалительно-деструктивной формы пародонтита с внедрением культуры аллофибробластов человека, заселенных на твердую мозговую оболочку.
В собственной диссертационной работе «Внедрение культивированных аллофибробластов в всеохватывающем лечении болезней пародонта» Г.С. Рунова на основании приобретенных экспериментальных данных внушительно показала эффективность разработанного необычного способа исцеления приобретенного пародонтита при использовании культивированных аллофибробластов и жесткой мозговой оболочки.
Преимущество данного метода исцеления пародонтита состоит в том, что в раневом ложе при имплантации ТМО и аллофибробластов не происходит так именуемого процесса биодеградации плодного материала и культивированных аллофибробластов, а имплантант встраивается в костный недостаток и трансформируется в предстоящем в грубоволокнистую костную ткань альвеолярных отростков. Культивированные аллофибробласты повсевременно выделяют основной фактор роста (FGF), сформировывают экстрацеллюлярный матрикс, фибронектин и другие вещества, которые содействуют активации процессов ангиогенеза и предстоящего остеогенеза.
В ближайшее время появились сообщения о способности внедрения фетальных фибробластов для восстановительной терапии в косметологии. 
В эмбриогенезе человека и млекопитающих образование нескольких сотен вариантов специализированных клеток происходит из пула зародышевых листков (эктодермы, энтодерма и мезодермы), также мезенхимы. Мезенхима - это клеточная сеть рыхловатой соединительной ткани, выполняющая множественные метаболические, сигнальные, механические (опорные) и морфогенетические функции. 
Фибробласты являются главным клеточным элементом среднего слоя кожи, именуемого дермой. Не считая фибробластов, дерма содержит некие другие типы клеток, также коллаген, эластин и гликозаминогликаны (межклеточное вещество), кровяные сосуды и железы (потовые и сальные) Основная функция фибробластов - синтезировать и ресоздавать межклеточное вещество. Фибробласты синтезируют и выделяют в окружающую среду огромное количество на биологическом уровне активных веществ, посреди которых можно выделить разные причины роста, составляющие внеклеточного матрикса и ферменты, при помощи которых они разрушают коллаген и гиалуроновую кислоту, также синтезируют эти молекулы поновой. Этот процесс происходит безпрерывно, и благодаря ему межклеточное вещество повсевременно обновляется. В особенности активно протекает метаболизм гиалуроновой кислоты. 
Как и во всех органах и тканях организма человека, в коже происходят возрастные конфигурации в течение жизни. Одной из главных обстоятельств старения кожи является понижение пролиферативной и синтетической активности фибробластов. В особенности стремительно теряется способность к синтезу межклеточного вещества. В то же время катаболические функции длительное время остаются на прежнем уровне. Потому в стареющей коже миниатюризируется толщина дермы, содержание воды в ней падает, в итоге кожа теряет упругость и упругость. Следствием этого является растяжение кожи и образование морщин.

Старение кожи на разных участках тела протекает неравномерно. В особенности стремительно стареют открытые участки кожи и кожа в местах сгибов. В то же время на закрытых областях возрастные конфигурации кожи наименее выражены.
В поликлинике целебной косметологии «Версаль» (г. Екатеринбург) проведено исследование эффективности продукта фетальных легочных фибробластов, выпускаемого Екатеринбургским НИИ вирусных зараз под заглавием «Культура диплоидных клеток человека для заместительной терапии». Количество пролеченных пациентов составило 61 человек, в т.ч. 43 дамы и 16 парней. Возраст пациентов - от 21 до 62 лет. Применены последующие методы введения продукта:
- Аппликация на кожу незапятнанного продукта;
- Аппликация на рану незапятнанного продукта под повязку;
- Аппликация продукта на кожу под маски и кремы;
- Нанесение продукта, подготовительного смешанного с масками и кремами;
- Введение продукта в кожу с помощью ультразвука, ионофореза, электрофореза;
- Внутритканевые инъекции продукта (внутрикожные, подкожные, в ткань рубца).
Продукт клеток употреблялся для исцеления угревой заболевания, возрастных конфигураций кожи, включая морщины кожи лица, рубцовых конфигураций кожи, также алопеции и гнездовой плешивости. Проведенные исследования продукта подтвердили высшую эффективность его внедрения в косметологии при лечении широкого диапазона болезней. Не было выявлено ни 1-го варианта осложнений, связанного с внедрением культуры фибробластов. По результатам исследования продукт рекомендуется для широкого внедрения в косметологической практике.
Приведенные данные свидетельствуют о огромных способностях восстановительной терапии при помощи фетальных фибробластов. По нашему воззрению, нужно расширять диапазон препаратов на базе фетальных фибробластов. Клеточная терапия основывается на принципе, что нездоровой либо стареющий орган должен лечиться либо стимулироваться материалом, приобретенным из подобного органа. 
В забугорной практике первыми зарегистрированными и разрешенными к клиническому применению коммерческими тканеинженерными продуктами стали конструкции для восстановления кожных изъянов, такие как Dermagraft (Smith Nephew), TestSkin II (Organogenesis), Apligraf (Organogenesis), AlloDerm (Life-Cell) [10,12,13]. В текущее время, пересадка этих материалов была произведена уже соткам тыщ пациентов с приобретенными язвами и ожогами. Но, было мировоззрение, что культивирование in vitro и фабрикация конструкта может структурно и/либо функционально поменять ДНК либо вызвать экспрессию, не соответствующих для начальной клеточки генов, к примеру онкогенов. Для оценки генетической безопасности обширно применяемых биокомпозитных материалов было нужно провести ряд исследовательских работ на предмет конфигураций происходящих в клеточках, нанесённых на конструкции при культивировании in vitro.

В недавнешнем номере Тissue Еngineering размещено сравнительное исследование генетического материала тканеинженерного продукта TestSkin II (Organogenesis) и клеток, приобретенных от доноров и культивированных in vitro по стандартному протоколу. TestSkin II был разработан для тестирования дерматотоксичных субстанций и моделирования искусственного дермогенеза in vitro и, выходит, по идентичной с Apligraf технологии.
Биоптаты кожи были получены от добровольцев мужского пола - новорожденного ребёнка и взрослых (55 и 96 лет). Эпидермальные кератиноциты и фибробласты были выделены и культивированы по стандартному протоколу производства TestSkin II. Потом была выделена их ДНК. Исследование ДНК проводилось при помощи нескольких спектрометрических и хроматографических способов. Раздельно анализировали ген TP53 способом капиллярного электрофореза. Ген ТР53 является антионкогеном и его повреждение наблюдается практически у всех пациентов с раком кожи. Не считая того, проводили исследования наличия Y хромосомы (способом FISH), которая может быть «потеряна» при продолжительном пассировании клеток.
В итоге, по данным спектрометрических способов, каких или статистически важных различий не было выявлено во всех 4 образчиках ДНК. Так как понятно, что 95% всех мутаций в антионкогене ТР53 происходят на уровне с 5 по 9 экзон [11], была проанализирована эта самая область. С вероятностью более 90%, было показано, что повреждения это гена во всех образчиках отсутствуют. При анализе Y-хромосомы после культивирования, было выявлено, что у 96 летнего донора произошла её утрата у 8% кожных фибробластов. Это событие создатели разъясняют как итог старения организма. Также, не было найдено окислительных повреждений ДНК, как в донорских тканях, так и в тканеинженерной конструкции TestSkin II.
Таким макаром, было показано, что процесс выделения и культивирования клеточного материала для тканеинженерных конструкций не вызывает повреждения ДНК. На примере кератиноцитов было также показано отсутствие изъянов ТР53, повреждение которого приводит к появлению злокачественных новообразований кожи. Результаты исследования ставят под колебание догадку о том, что процессы выделения и культивирования клеток для тканеинженерной пластики, по стандартным протоколам, может привести к повреждению ДНК. 
ISOLAGEN (Лондон) было подтверждено, что разработка введения собственных аутоиммунных фибробластов кожи является неопасной и действенной процедурой, испытанной в 7 летних клинических испытаниях в США и Англии. В исследовании было вовлечено примерно 1200 пациентов добровольцев, изготовлено около 3500 инъекций. Широкие клинические тесты демонстрируют, что некие пациенты лицезреют поразительные результаты уже через несколько недель, тогда как другие могут ждать конфигурации только через несколько месяцев. Но с момента ввода аутоиммунных фибробластов кожи пациенты лицезреют долгое повышение клеток прямо до 18-24 месяцев. Итог сохраняется до 7 лет после исцеления.

На базе поликлиники «Technology Serves» были проведены сравнительные работы по применению препаратов фетальных и постнатальных аутогенных культур фибробластов кожи и жира на добровольцах - женщинах и мужиках 32-65 лет, с целью корректировки возрастных конфигураций кожи лица и области шейки. Проводилась корректировка глубочайших морщин кожи, маленьких морщин вокруг глаз, лифтинг лица. Пациенты и пациентки наблюдались в течение 18 месяцев, отмечен стойкий полезный эффект, заключавшийся в исчезновении маленьких и уменьшении больших морщин, также в общем улучшении состояния кожи. Способом размножения клеток показано, что фибробласты, приобретенные от взрослых людей, сохраняют высшую способность к пролиферации. Изготовлен вывод о перспективности внедрения аутогенных фибробластов в терапевтической косметологии. 
В текущее время можно выделить два главных подхода к исцелению изъянов кожи при помощи препаратов, содержащих нативные фибробласты. С одной стороны, широкую известность получили методики исцеления изъянов кожи раневого и ожогового нрава при помощи культур аллогенных фетальных фибробластов [1] . Кандидатурой этим методикам является возможность использования собственных фибробластов человека для заместительной клеточной терапии кожных покровов [4]. 
Любой из вышеуказанных подходов имеет свои плюсы и недочеты. Целью проведенной в «Technology Serves» работы явилась отработка в специализированных клиниках методик корректировки возрастных конфигураций кожи при помощи собственных фибробластов кожи и жира пациента, культивированных in vitro.
Методика была апробирована в Англии (Лондон) и на Украине (Киев) у 48 пациентов в возрасте 32-65 лет с признаками естественного увядания кожи лица и шейки. 
Разработка данного способа исцеления с применением клеточных препаратов включала три шага. Сначала была отработана воспроизводимая методика изготовления неопасного для человека и предположительно действенной технологии. Эффективность потом инспектировали на сделанных с внедрением животных и клеточных культур моделях кожи. Потом проводили тесты на ограниченном числе нездоровых в поликлинике. После удачного окончания данного шага провели широкие тесты в ряде клиник и на значимом количестве пациентов. 
Клеточный материал для получения культуры аутогенных фибробластов брали методом биопсии кожи пациента в области предплечья, также из жировой ткани из области животика. Параллельно фетальные фибробласты были получены из кожи 8-12-недельных человечьих зародышей, как описано в работе [3].
Получение и культивирование фибробластов из биоптата кожи и жира проводили по стандартной методике. Для получения первичной культуры клеток ткань промывали физ. веществом, содержащим лекарства, и обрабатывали веществом, содержащем ЭДТА, трипсин и коллагеназу. Потом клеточки первичной культуры центрифугировали, отмывали от ферментов, и ресуспендировали в среде культивирования. При культивировании использовалась среда, содержащая 90% DМЕМ + 10% эмбриональной телячьей сыворотки. 
После выработки достаточного количества клеток (5-6 пассажей в культуре) фибробласты тестировались на отсутствие контаминации ВИЧ, гепатитов А, В и С, ЦМВ, микоплазмы, хламидий и других заразных болезней. Тестирование проводилось с помощью ПЦР и иммуноферментными способами. Дальше монослойные культуры клеток суспендировали в стерильном физрастворе для инъекций. Готовые суспензии сохраняли при +4 С. Препараты клеток использовали в течение 24 ч после получения. 
Функцию введения клеток пациенту проводили однократно способом туннельных инъекций для больших морщин, либо обкалывания маленьких морщин, либо мезотерапии кожи лица. Количество клеток в продуктах варьировало зависимо от процедуры, объем введенного продукта составлял в среднем 10 -15 млн. и доходил за 3 процедуры до 30 - 50 млн. клеток фибробластов кожи и 15 - 25 млн. клеток для фибробластов жировой ткани. 
Выкармливание фибробластов проводили, как описано в работе [3]. Трипсинизацию клеток проводили при помощи версена и трипсина при 4С. По 2 мл взвеси клеток высевали на пластмассовые чашечки Петри (поперечником 40 мм) и инкубировали клеточки в критериях насыщающей влажности при 37оС с 3 - 5% СО». Число колоний определяли на 14 - 18-е день после посева клеток. Клеточки фиксировали 10%-ным веществом формалина и окрашивали 0.1%-ным веществом метиленового голубого. Эффективность способа определяли как отношение числа колоний к числу посеянных клеток. За эффективность прикрепления воспринимали отношение числа клеток, прикрепившихся через 12 ч после посева, к числу посеянных. В качестве контроля использовали штаммы фибробластов, приобретенные из кожи зародышей 8-12 недель гестации. Всего исследовано 8 штаммов фибробластов человека, 5 - приобретенных из зародышей и 3 - из кожи взрослых индивидуумов.
Жизнеспособность клеток в суспензии определяли при помощи высевания суспензионной культуры через разные сроки инкубации и подсчета количества прикрепившихся клеток по их возможности к образованию колоний. 
Для фетальных штаммов эффективность колонирования, т.е. способность клеток создавать колонии, состоящие из 16 и поболее клеток, колебалась от 38 до 82%, для постнатальных штаммов - от 12 до 60%.

Препараты аутогенных фибробластов были использованы в поликлинике «Technology Serves» у 32 человек, в анамнезе которых не было указаний на аутоиммунные болезней соединительной ткани (системная красноватая волчанка, ревматоидный артрит, псориаз и т.д.). Количество вводимых клеток составляло в среднем 1х10*7 за 1 функцию. В предстоящем дозы повторялись дважды через 14 дней. Суммарная доза вводимых аутогенных фибробластов кожи составляла в среднем 30 млн., и для фибробластов жира - 15 млн. В 1-ые часы после введения клеток следили местные эффекты в виде эритемы и маленького отека, которые исчезали через 2-3 ч после процедуры. Полезный эффект начинал проявляться через 6-8 часов после процедуры и выражался в увеличении тургора и эластичности кожи, ее кровоснабжения. Отмечен стойкий полезный эффект, заключавшийся в исчезновении маленьких и уменьшении больших морщин. Значимый осязаемый полезный эффект наблюдался уже после ввода 2-ой дозы 10 млн. фибробластов кожи (5 млн. фибробластов жира). Сохранение полезного эффекта к истинному времени прослежено в протяжении 18 месяцев. 
В работу не заходил сравнительный анализ приобретенного эффекта от введения фибробластов кожи и жира. Но при внедрении фибробластов, приобретенных из жира, результаты «омоложения» кожи существенно превосходили. 
Эффект внутрикожных инъекций фетальных фибробластов был исследован у 16 парней и дам, которым однократно вводили по 1-1,5 мл клеточной суспензии. Концентрация клеток составляла 0,25, 0,5, 1,0, 3,0 и 5,0 млн. клеток в мл суспензии. Лучшие результаты получены при внедрении 3,0 млн. клеток. Полезные эффекты наблюдались через 2-3 денька после процедуры и были подобны результатам введения собственных клеток. Но было отмечено, что продолжительность эффекта «омоложения» от аллогенных фибробластов было короче, чем при внедрении аутофибробластов. 
Для корректировки возрастных конфигураций кожных покровов в текущее время употребляются самые различные способы (пилинги, шлифовка, лифтинг и др.) и препараты (токсин ботулизма («ботекс»), составляющие внеклеточного матрикса и соединительной ткани и т.д.). Применение культур клеток для омоложения кожи в косметологии началось сравнимо не так давно, при всем этом использовались как фетальные аллогенные [1], так и аутогенные фибробласты [4]. При всем этом не появляется сомнения об эффективности данного внедрения для клеточной терапии, в особенности у взрослых и пенсионеров.
Считается, что лучшие результаты клеточной терапии получаются при использовании культур фетальных фибробластов, которые имеют больший пролиферативный потенциал по сопоставлению с культурами от взрослых доноров. Но применение клеток, приобретенных из зародышей, имеет ряд ограничений, в том числе этического нрава. В то же время скапливаются данные, что собственные фибробласты, равно как и стволовые клеточки человека, сохраняют собственный потенциал при старении, невзирая на уменьшение их числа в стареющем организме. 
В работе Келлера с соавт. [4] клиентам в возрасте 37-61 года вводили аутогенные фибробласты кожи. Значимый и стойкий клинический эффект наблюдался у пациентов при корректировки носогубных складок, также у пациентов с рубцами. Приобретенные нами результаты также демонстрируют, что фетальные и постнатальные фибробласты оказывают подобные полезные эффекты при внедрении клиентам. 
Тесноватая связь меж мезенхимальными стволовыми клеточками и фибробластами в культуре отмечена еще в работах первооткрывателя стволовых клеток А.Я.Фриденштейна посреди 60-х годов прошедшего столетия [7]. В его лаборатории в первый раз была получена однородная культура плюрипотентных стромальных стволовых клеток костного мозга, прикрепленных к подложке, которые сохраняли высочайший темп размножения в недифференцированном состоянии в почти всех пассажах. Работы Фриденштейна проявили, что мезенхимальные стволовые клеточки после прикрепления при пересеве с малой плотностью сформировывали копии фибробластоподобных нефагоцитирующих клеток. 
В предстоящем связь меж фибробластами и мезенхимальными стволовыми клеточками была доказана другими исследователями, но имелось мировоззрение, что фибробласты при культивировании утрачивают способность к дифференцировке в другие типы клеток. В исследовательских работах последних лет [9] показано, что фибробласты потенциально могут получать характеристики клеток скелетной мускулатуры, при данной дифференцировке in vitro, если они трансплантируются в регенерирующую скелетную мышцу. 
Также показано, что пролиферативный ответ культивируемых фибробластов на стимуляцию цитокинами и синтез коллагена и неколлагеновых белков после стимуляции трансформирующим фактором роста бета не зависели от возраста донора клеток [6]. 
Cristofalo с соавт. [5] в недавнешней работе подвел результат своим долголетним исследованиям по связи возраста донора и возможности его клеток к пролиферации. Создатели обусловили длительность жизни клеток кожи из биопсийного материала 124 клинически здоровых доноров различного возраста и сделали конкретный вывод, что длительность жизни фибробластов в культуре не коррелирует с годами донора.
Приобретенные широкие результаты по эффективности выведения фибробластов также свидетельствуют о сохранении высочайшего пролиферативного потенциала клеток у взрослых людей при сопоставлении с фетальными фибробластами. 
Одно из разъяснений этого парадокса заключается в том, что при культивировании аутогенных фибробластов in vitro происходит их частичная реактивация либо «омоложение», т.е. возврат в состояние, более близкое к мезенхимальным стволовым клеточкам. Первичная культура, приобретенные после трипсинизации биопсийного материала, содержит как «юные», так и «старенькые» клеточки. Все эти клеточки помещаются в среду, содержащую эмбриональную сыворотку, т.е. в условия, в некий степени подобные имеющимся в эмбриональном состоянии. При всем этом происходит стимуляция пролиферации «юных» клеток, сохранивших высочайшие возможности к росту, и разбавление либо вымывание из культуры «старенькых» клеток, которые утратили способность к пролиферации. Таким макаром, культура вроде бы «омолаживается». Не исключена возможность и настоящей реактивации либо омоложения клеток в таких критериях культивирования, как было показано еще Makinodan при пересадках иммунокомпетентных клеток от старенькых мышей юным мышам.
При оборотной пересадке в кожу пациента такая реактивированная культура клеток, разумеется, будет интенсивно заселять дерму и усиленно синтезировать весь комплекс компонент внеклеточного матрикса и причин роста, нужный для поддержания кожи пациента в рациональном физиологическом состоянии. Принципиально отметить снова, что это собственные клеточки пациента, которые, «взрослея», не будут поглощаться макрофагами в отличие от пересаженных аллогенных фетальных клеток.
Необходимо подчеркнуть, что в работе Келлер полезный эффект следили как минимум в течение 12 мес. после пересадки аутогенных фибробластов. Способ внедрения фибробластов кожи и жира является более хорошим, чем инъекции ботулинового токсина («ботокса»), который при продолжительном применении может вызывать дегенерацию нервных окончаний и нарушение трофики кожи. Не считая того, этот способ является более прогрессивным, чем внутрикожные инъекции компонент внеклеточного матрикса. Такие инъекции оказывают омолаживающий эффект, но этот эффект краткосрочный, и инъекции нужно повторять. Не считая того, введение излишка компонент матрикса может оказывать тормозящее воздействие на синтез и секрецию этих компонент клеточками кожи и, таким макаром, косвенно ускорять старение фибробластов кожи.
В целом, полезный эффект внедрения препаратов фибробластов у пациентов показывает на высочайший восстановительный потенциал аутологичных фибробластов для корректировки возрастных конфигураций кожи. Последующие исследования должны быть ориентированы на оптимизацию схемы терапии, установку личных доз вводимых фибробластов и наблюдение в динамике для установления отдаленных результатов. 
Институтом клеточных технологий вместе с НИИ трансплантологии и искусственных органов, при участии Русского Муниципального Мед Института в реальный момент в лабораторных критериях проводятся научные работы по сопоставлению белковых маркеров, получение протеомных карт фибробластов, взятых от взрослых доноров из области кожи, мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК КМ), мезенхимальных стволовых клеток, приобретенных из жировой ткани (МСК жира) и фетальных фибробластов кожи.

Поиск доступных источников фибробластов на сегодня остается очень животрепещущей задачей, от удачного решения которой почти во всем зависит предстоящее развитие клеточной терапии. 
В свете вышесказанной трудности повышенное внимание заслуживает размещенная в 2001 году работа Zuk и соавт (Zuk et al., 2001), в какой описан способ получения стромальных фибробластоподобных клеток из жировой ткани взрослого человека и показана их способность дифференцироваться в разные спец клеточки (остеоциты, хондроциты, миоциты и адипоциты). Выявленный новый, фактически неограниченный источник (Aust et al., 2004) адипогенных стромальных клеток (АСК) - обычно, это отходы косметологической липосакции - обещает революционные конфигурации в сфере клеточной терапии. Перспективы внедрения АСК для исцеления и восстановления покоробленных тканей очень заманчивы и близки, но до начала полного использования их потенциала нужно разрешить некие трудности. Так в 2002 году способом "редчайшей посадки" было получено несколько сотен клонов АСК, любой из которых представлял итог деления одной клеточки. Исследование полипотентности клонов показал, что способностью дифференцироваться в 3-х направлениях (остеогенном, адипогенном и хондрогенном) обладает только ~1% АСК (Zuk et al., 2002). При всем этом, как ни удивительно, морфология, и профиль CD маркеров адипогенных полипотентных клеток (АПК) схож клеточкам не владеющим какой-нибудь потентностью (Zuk et al., 2002). Каковы главные последствия данного факта? Непременно, это суровое препятствие на пути лабораторного и клинического исследования способов клеточной терапии на базе адипогенных СК, т. к. не представляется вероятным охарактеризовать клеточный материал, приобретенный из отходов липосакции, на предмет содержания в нем стволовых клеток. С другой стороны, это неувязка выделения АПК из АСК современными способами сепарации клеток основанных на иммуносорбции (применение магнитных бус, аффинных колонок и цитосортеров), что требуют познания соответствующих клеточных антигенов - поверхностных белков клеточки взаимодействующих с антителами. Таким макаром, существующая неувязка идентификации и сепарации на самом деле стволовых АПК от АСК, на самом деле обычных фибробластов, может быть решена только сравнительным исследованием этих клеток. Популярная их морфологическая, антигенная и генетическая (т.к. общий геном) идентичность делает животрепещущим дифференциальное описание белкового состава этих клеток. При всем этом кроме цитоплазматических белков клеток особенный энтузиазм представляют мембранные белки, являющиеся возможными мишенями для маркеров цитосортировки (к примеру, меченых антител). 
Высокоэффективный протеомный анализ, применяемый в работе Института Клеточных Технологий, НИИ трансплантологии и искусственных органов, Русским Муниципальным Мед Институтом являются способам выбора в случае картирования белков таких сложных био систем, какими являются клеточки. В согласовании с данным проектом подразумевается применение двумерного электрофореза для разделения белков с следующей их идентификацией времяпролетной масс-спектрометрией (2D-PAGE + MALDI-TOF MS). Схожая схема анализа позволяет прокартировать до 2 тыщ белков био объекта. Дифференциальный анализ приобретенных протеомных карт АПК и АСК позволит выявить отличия в составе цитозольных белков связанных с полипотентностью. Подобные данные, непременно, являются как ценной научной информацией, так и могут в предстоящем употребляться для сертифицикации клеточного материала для клинических испытаний.

Таким макаром, отрабатываются модели и способы получения препаратов фибробластов из кожи и жировой ткани человека, применимые для внедрения в косметологии. В почти всех работах показывается сохранение высочайшей возможности к пролиферации фибробластов, приобретенных от взрослых доноров. Проводятся тесты по применению приобретенных препаратов для корректировки возрастных конфигураций кожи. Подготовительные данные демонстрируют значимый и стойкий хороший результат, указывают на высшую перспективность внедрения культуры аутогенных фибробластов в терапевтической косметологии. 
Применение фибробластов в поликлинике эстетической медицины может быть по последующим главным фронтам:

Косметология 
Трихология
Комбустиология 
В качестве сопутствующей Anty-Age терапии.