Только в США более 100 миллионов пациентов страдают от трудно- или долго незаживающих переломов костей, приводящих к несращениям, неправильным и замедленным сращениям костей. Многие переломы с высоким риском требуют подсадки костей или других крупных хирургических вмешательств. В результате связанного, например, с остеосаркомой, хирургического удаления больших участков длинных костей образуются крупные костные дефекты.

В настоящее время для заполнения таких дефектов чаще всего используются аллографты. Очевидно, что при использовании донорской ткани существует риск переноса инфекций, например, ВИЧ, гепатита, и, возможно, других (даже неизвестных) болезней. Альтернативный подход - использование синтетических наполнителей, но самое оптимальное решение проблемы - собственная костная ткань пациента. Такие большие дефекты кости не поддаются другим современным методам лечения, например, при помощи морфогенетических белков кости (bone morphogenetic proteins).

В настоящее время материал для аутотрансплантации берется из подвздошного гребня - вырезаются куски соответствующей формы и используются для заполнения дефектов. Однако эта процедура еще не отработана и во многих случаях весьма болезненна; иногда заживление поврежденного при этом участка кости идет больше года. Тканевая инженерия и в этом случае может обеспечить более изящный подход.

Показано, что клетки костного мозга обладают остеогенным потенциалом. Чтобы получить эти клетки, нужна небольшая биопсия из подвздошной кости. Клетки можно размножать в культуре, высеивать на подложку и через несколько недель выращивания носитель с аутологичными клетками может быть использован для заполнения дефекта. В этом направлении работает несколько компаний и исследовательских институтов. Над выделением, культивированием, высеванием на подложку и последующей имплантацией МСК работает компания Osiris. Сейчас компания проводит 1 фазу клинических испытаний для проверки безопасности метода, в котором аутологичные МСК на гидроксиапатитном матриксе используются для регенерации альвеолярного гребня перед имплантацией зубов. В течение последнего года ученые из Osiris Therapeutics Inc также показали в преклинических испытаниях на собачьей модели возможность использования полностью несовместимых аллогенных МСК для восстановления крупных костных дефектов. В ближайшем будущем будут проведены дополнительные исследования для определения наилучшего состава матрицы, на которой вносятся МСК. Компания IsoTis работает несколько в ином направлении, культивируя клетки костного мозга. Предшественники костных клеток стимулируются к дифференцировке в остеобласты и высеиваются на подложки. После этого клеткам позволяют сформировать матрикс и получившийся материал имплантируют пациентам.

Для применения МСК для тканевой инженерии и регенерации есть некоторые ограничения. Это относительно низкая частота встречаемости этих клеток в строме костного мозга - только одна из 100 000 клеток является действительно стволовой. Кроме того, способность этих клеток к самообновлению ограничена, а с возрастом уменьшаются как возможности пролиферации, так и способности к дифференцировке в специализированные типы клеток. Таким образом, все еще сохраняется необходимость поиска альтернативных источников клеток для целей тканевой инженерии скелета. В этом отношении подходящим источником клеток для тканевой инженерии и восстановления могут быть эмбриональные стволовые клетки. При помощи манипуляций условиями среды, при которых происходит дифференцировка ЭСК, возможно контролировать пути дифференцировки и таким образом создавать культуры клеток, обогащенные специфическими предшественниками. Используя такой подход, стимулировали к дифференцировке в остеобласты мышиные ЭСК (Buttery et al 2001).

Другой подход - прикреплять тонкий слой живых клеток на матрикс суставного импланта, как при повторной артропластике тазобедренного сустава. В большинстве случаев операции по установке первичных имплантов очень успешны, но если первичное устройство в конечном итоге выйдет из строя, доля успешных попыток  повторной артропластики тазобедренного сустава бывает намного ниже. Концепция тканевой инженерии в этом отношении - покрыть повторный имплант тазобедренного сустава тонким слоем фосфата кальция, на который посеяны аутологичные остеобласты, полученные и культивированные, как описано выше. Ожидается, что это ускорит формирование матрикса, способствуя врастанию остеобластов, а также лучшей и скорейшей фиксации повторного импланта. Конечная цель - достичь лучших долговременных результатов повторной артропластики. Очевидно, чтобы получить долговременные результаты, потребуется много лет, но ускорение восстановления после повторной артропластики и перспективы лучшей и более продолжительной фиксации дают преимущества, перевешивающие издержки дополнительного вмешательства.

 

 

Восстанавливающие ткань клетки компании Aastrom (Aastrom's Tissue Repair Cells (TRCs)) для трансплантации кости выращиваются из маленьких образцов костного мозга, содержащих взрослые стволовые клетки при помощи Системы воспроизводства клеток AastromReplicell System. Среди этих клеток много стволовых и ранних клеток-предшественников, формирующих кость и другие ткани; причем число предшественников костных клеток более чем в 80 раз превышает число клеток других типов. К настоящему времени этот продукт был безопасно использован более чем для 150 пациентов, чтобы сформировать нормальный костный мозг, кровь и клетки иммунной системы. Результаты исследования показали способность TRC формировать кости скелета у пациентов с генетическими болезнями костей (Whyte et al 2003). Компания Aastrom проводила клинические испытания в Bergmannsheil University Clinic (Bochum, Germany), используя TRC на коммерческом синтетическом матриксе компании Mathys Medical Ltd (Bettlach, Switzerland) для лечения пациентов, которые нуждались в трансплантации из-за несращения фрагментов большой берцовой кости. Клинические испытания планируются также и в США.

 

 

Крупные дефекты костей черепа могут быть результатом повреждений при удалении кости для снятия давления на мозг или при удалении опухолей, затронувших черепные кости. Обычно такие дефекты закрывают, если это возможно, удаленными фрагментами кости, или синтетическими материалами, или аутологичными трансплантатами кости. Фрагменты кости для трансплантации обычно берут из подвздошной кости пациента, но их не всегда хватает, чтобы закрыть обширные дефекты. Неудачи в восстановлении повреждений могут привести к крупным уродливым дефектам, при которых виден пульсирующий мозг и необходимо носить защитный шлем. Восстановление очень крупных дефектов у маленьких детей проблематично из-за того, что трансплантат не растет по мере роста черепа.

Обширные дефекты черепа у детей восстанавливали при помощи ограниченного количества аутологичной губчатой костной ткани, полученного из аутологичных стволовых клеток жировой ткани, которые во время операции накладывали на дефект (Lendeckel et al 2004). Клетки удерживались на месте при помощи аутологичного фибринового клея. Сначала появлялись маленькие участки костной ткани, которые давали стволовым клеткам инструкции становиться клетками кости, и в результате дефект успешно замещался естественно выглядящей костью. Осложнений не было, и этот подход открывает путь использования аутологичных стволовых клеток для восстановления костных дефектов.

 

 

Еще одна сложная задача для основанных на МСК конструкций - гибридные ткани, такие как искусственный хрящ на подложке из субхондральной кости, или ткани сухожилий с функциональным прикреплением к кости. В конечном итоге формирование ex vivo пригодных для имплантации сложных трехмерных тканей с сетью сосудов произведет революцию в лечении поврежденных или больных тканей.

Для обеспечения жизнедеятельности кости из стволовых клеток дифференцируются остеобласты, но МСК способны давать и другие ткани, кроме костной. Однако было показано, что более примитивные клетки, сторонняя популяция (side population (SP)) стволовых клеток костного мозга, могут дифференцироваться и в гемопоэтические, и в мезенхимальные клетки (Olmstead-Davis et al 2003). Трансплантированные летально облученной мыши меченные одним геном мышиные SP клетки восстанавливали уничтоженный пул остеопрогениторных клеток, так что большая часть остеогенных клеток в эпифизах длинных костей имела маркер донорских клеток. Эти данные наводят на мысль, что способности к развитию клеток сторонней популяции не ограничиваются гемопоэтической линией, но распространяются на остеогенную дифференцировку. Это свойство не только проливает свет на неизученную ранее стадию развития остеобластов, но также имеет захватывающее перспективы использования SP клеток в клинической ортопедии и при болезнях костей, причина которых лежит в стволовых клетках.  

Когда-нибудь мы сможем контролировать формирование восстанавливающихся тканей in vitro и in vivo, и следующим рубежом будет обеспечение клинических преимуществ, лежащих в изготовлении тканей, которые могут быть созданы без долгого и обременительного процесса получения стволовых клеток, очистки их, размножения в культуре и процесса легализации метода. Предварительные эксперименты наводят на мысль, что МСК человека и животных не экспрессируют ко-стимулирующие антигены, такие, как В7, и таким образом, являются иммуннопривилегированными. В недавнем эксперименте на собаках несовместимые по главному комплексу тканевой совместимости (major histocompatibility complex (MHC)-mismatched) МСК, имплантированные в большой костный дефект, смогли сформировать значительное количество костной ткани в месте повреждения без признаков иммунного отторжения. Хотя лежащие в основе всех этих интересных наблюдений молекулярные механизмы не определены, эти результаты указывают на возможность найти универсальные донорские клетки для подобных тканеинженерных применений. По сути, эти клетки могут быть необходимы только для того, чтобы вызвать каскадную реакцию регенерации ткани; интеграция новой или ремоделированной ткани может быть результатом последующего вклада мобилизированных аутологичных МСК в место восстановления.

В эксперименте при резекции лучевой кости и имплантации в зону образовавшегося дефекта фрагментов деминерализованной кости с иммобилизованными МСК восстановление целостности длинных трубчатых костей происходило вдвое быстрее - через 5 недель вместо 10 недель в контроле (использование фрагментов деминерализованной кости без МСК). Такой вывод был сделан на основании динамического изучения рентгенограмм и результатов гистологического исследования регенерата лучевой кости (Зорин и др. 2004).

Первый опыт применения в травматологии и ортопедии культивированных аутогенных клеток принадлежит российским специалистам, которые таким образом лечили осложнения переломов - ложные суставы и дефекты длинных костей конечностей (Осени и др. 1982).

В НИИТиИО для ускорения темпов и качества лечения ложных суставов и дефектов бедренной кости использовали васкуляризованные костные аутотрансплантаты с одномоментной трансплантацией плюрипотентных стволовых клеток костного мозга, сорбированных на коллагеновой губке. При этом формирование костной мозоли и восстановление функции конечности наступало, в среднем, на 1,5-3,0 месяца раньше, чем после пластики дефектов васкуляризованным аутотрансплантатом малоберцовой кости без дополнительного применения плюрипотентных стволовых клеток костного мозга (Быстров и др. 2003).

В клинических исследованиях на людях в США первоначально усилия были сосредоточены на приложении восстановления тканей при помощи МСК, не требующем трехмерной матрицы для введения клеток. На это было много причин, но главные из них - препятствия, связанные с государственным регулированием сочетания клеток и имплантируемых устройств, и недостаток биоматериалов, одобренных FDA, которые подходили бы для структурной регенерации тканей. Поскольку МСК могут дифференцироваться в специализированные клетки стромы костного мозга, которые обеспечивают структурную и информационную поддержку гемопоэза, МСК использовали для вспомогательного режима инфузий при трансплантации костного мозга после высокодозной химиотерапии. Была гипотеза, что после удаления или повреждения нативной стромы костного мозга и инфузии в кровоток МСК они избирательно «идут домой» в костный мозг, откуда они происходят, чтобы восстановить поддерживающую строму. Эффективность хоминга никогда не измерялась, но данные последних работ показывают, что она довольно низка, возможно, порядка 1-2% введенных клеток. Увеличение эффективности приживаемости МСК и направления их к определенной ткани может иметь большое влияние на будущее терапевтическое использование МСК для лечения других болезней. Наиболее очевидное приложение для системного повышения индивидуального титра МСК - связанный с возрастом остеопороз после менопаузы, поскольку причиной утраты способности к формированию костной ткани может быть уменьшение запаса локальных МСК. Вдобавок, МСК можно инъецировать в полость суставного хряща, чтобы они принимали участие в восстановлении или регенерации мениска или суставного хряща. Методы стимуляции экспрессии специфических лигандов поверхности клеток, естественных или искусственных, которые могут опосредовать избирательное прикрепление к известным рецепторам в ткани-мишени, дадут значительные клинические преимущества.

С разработкой материалов для имплантации, в которые можно инкапсулировать факторы роста и цитокины, однажды станет возможным манипулировать эндогенными МСК для стимуляции регенерации тканей. Метод будет включать последовательное привлечение МСК химическими веществами, размножение их в нужном месте и индукцию их дифференцировки в специализированные клетки.  В настоящее время введение в нужное место даже одного биологически активного фактора, воздействующего на МСК, остается клинической проблемой. Очевидно, что управление МСК in vivo требует более точного понимания роли каждого из клеточных и молекулярных участников каждого направления дифференцировки. Конечно, для разработки и производства в лаборатории таких сложных структур, как кость, будет необходимо одновременно управлять развитием и других тканей, например, сосудистой системы. Пока еще остается невыясненным, являются ли эти «биоактивные факторы», которые используются для стимуляции этих процессов, растворимыми рекомбинантными молекулами, которые связываются с обычными рецепторами поверхности клетки и инициируют классический сигнал о направлении дифференцировки. Альтернативный подход к изменению запрограммированной последовательности внутриклеточных событий в МСК может быть направлен на разработку маленьких синтетических молекул, способствующих или препятствующих этим процессам и направленным к конкретным цитоплазматическим целям, или разработке новых соединений, способных проходить через мембрану ядра и стимулировать транскрипционные события на уровне промоторов генома. Наконец, при некоторых патологиях, когда рост и/или дифференцировка стволовых клеток выходят из-под контроля, например, при различных опухолях или при гетеротопных оссификациях - болезни, называющейся оссифицирующая прогрессирующая фибродисплазия, - может быть необходимо контролируемое подавление пролиферации и некоторых направлений дифференцировки  МСК, которое может осуществляться при помощи специально разработанных молекул на уровне отдельных клеток или кластеров.

Для контроля регенерации костной ткани может быть использована система регуляции стволовых клеток, в которой применяются генно-инженерные МСК со встроенным вектором, кодирующим остеогенный человеческий фактор роста BMP-2 с регулируемой тетрациклином экспрессией (Moutsatsos et al 2001). Доксициклин (аналог тетрациклина) может контролировать экспрессию BMP-2 и таким образом управлять остеогенной дифференцировкой МСК in vivo и in vitro. После трансплантации генетически модифицированных МСК введение доксициклина контролирует как формирование, так и регенерацию костной ткани. Более того, в этой работе показано сопровождающее формирование кости увеличение ангиогенеза при стимуляции экспрессии BMP-2 в генно-инженерных МСК in vivo. Таким образом, регулируемая экспрессия гена в МСК может использоваться как инструмент управления заживлением костной ткани.

Обратная транскриптаза человеческой теломеразы (human telomerase reverse transcriptase (hTERT)) преодолевает барьеры, препятствующие дифференцировке СК стромы костного мозга и росту костной ткани, и трансдукция ею стромальных клеток при помощи ретровирусных векторов может привести к экспрессии hTERT (Shi et al 2002). В этом исследовании показано, что трансдуцированные клетки в течение 2,5 лет делились более 260 раз, в то время как нетрансдуцированные клетки старели уже после 32-кратного удвоения популяции. После трансплантации иммуннодефицитной мыши трансдуцированных клеток из них вырастала кость, в которой присутствовали ламеллярные клетки, остеобласты, инкапсулированные остеоциты и фиброзные ткани с элементами кроветворного костного мозга.

 

 

Несовершенное костеобразование (оsteogenesis imperfecta) - генетическая болезнь, в результате которой возрастает хрупкость костей, уменьшается костная масса и происходят нарушения формирования соединительной ткани. Как часть пилотного исследования, была проведена клеточная терапия - одному пациенту выполнили трансплантацию костного мозга. Насколько успешно лечение, пока еще не установлено. Неизвестно, какое количество нормальных клеток требуется для улучшения клинического состояния.

Фетальные МСК могут быть ценным источником клеток для клеточной терапии этого состояния. В Karolinska Institutet (Stockholm, Sweden) была проведена трансплантация HLA-несовместимых МСК 32-недельному плоду с множественными переломами, диагностированными как тяжелое несовершенное костеобразование (Götherström 2004). На 35 неделе было проведено кесарево сечение. Когда пациенту было 9 месяцев, при совместном культивировании его лимфоцитов с донорскими МСК не было отмечено пролиферации лимфоцитов, что показывает отсутствие иммунной реакции на эти аллогенные клетки. В течение первых двух лет жизни было отмечено три перелома; функция роста оставалась неизменной. Таким образом, аллогенные несовместимые МСК могут быть безопасно трансплантированы до рождения пациентам с тяжелым несовершенным костеобразованием; эти клетки приживаются в костной ткани. Результаты этой работы показывают, что фетальные МСК являются иммунологически привилегированными клетками и обладают потенциалом для аллогенной трансплантации.

 

 

Остеоартрит - дегенеративная болезнь, при которой происходит эрозия суставной поверхности, в конечном итоге приводящая к полному разрушению хрящевой поверхности и болезненному обнажению подлежащей кости. Ревматоидный артрит - системное заболевание, происходящее в результате воспаления синовиальной ткани  и последующего разрушения хряща и кости. Разработка эффективных методов лечения этих болезней идет медленно, и в настоящее время большинство рекомендующихся средств только облегчает симптомы, но не влияет на течение болезни. Во многих случаях хирургическая замена сустава является лучшей возможностью восстановления его нормальной функции.

В нормальных суставах хрящ обеспечивает гладкую несущую поверхность, позволяющую суставу свободно двигаться. В хрящевой ткани нет сосудов и мало клеток, но много внеклеточного матрикса. Непроникающие дефекты хряща плохо заживают, потому что не происходит мобилизации хондроцитов в непосредственной близости от места повреждения и недоступны клетки-предшественники хрящевой ткани из костного мозга. Из-за того, что хрящ лишен способности регенерировать после повреждения, повреждение этой ткани в результате травмы прогрессирует в остеоартрит.

Применяющиеся в настоящее время методы терапии не могут обеспечить полного и устойчивого излечения осложнений, следующих за повреждением суставного хряща. Цель лечения повреждений суставного хряща - восстановление или регенерация поврежденной поверхности и в результате устойчивое долговременное снятие клинических симптомов. При использовании патогенетических методов терапии уже поврежденная хрящевая ткань не восстанавливается. В 30% - 50% наблюдений после перенесенного септического артрита остаются осложнения в виде артралгии и скованности суставов.

Остеоартроз (ОА) - хроническое заболевание суставов, которое характеризуется прогрессирующей дегенерацией суставного хряща, а также структурными изменениями всех других компонентов сустава, включая синовиальную оболочку, субхондральную кость, связки, капсулу и периартикулярные ткани. При ОА из-за обменной дисфункции в тканях сустава начинают накапливаться аутоантигены, которые становятся источником резкой активации местной воспалительной реакции в матриксе хряща, а также причиной повреждения и даже разрушения суставного хряща. Противовоспалительная терапия остеоартроза часто являлась недостаточно эффективной, кратковременной и нередко сопровождалась нежелательными реакциями, особенно у людей старшего и пожилого возраста. С начала 80-х годов ХХ столетия стала развиваться репаративная стратегия, предусматривающая восстановление хрящевой ткани на фоне высокой активности катаболических процессов с помощью хондроитина, глюкозамина и гиалуроновой кислоты, представляющих собой компоненты нормального хряща. Они повысили эффективность традиционной медикаментозной терапии, но применение их по прежнему оказалось явно недостаточным, потому что в поражённом суставе нарушена программа адекватной утилизации субстратов, используемых для восстановления хряща из-за имеющегося в нём иммунного дисбаланса.

Для восстановления иммунного баланса и программы восстановительной репарации поражённого сустава в НИИТиИО (Москва) дополнительно к медикаментозной противовоспалительной и хондропротекторной терапии был применён метод информационной коррекции восстановительных процессов путём введения под капсулу поражённого сустава прекультивированных стволовых и прогениторных клеток гемопоэтической фракции аутологичного костного мозга. Клетки костного мозга, полученные из подвздошной кости, предварительно культивировали в питательной среде mix DMEM/Ham F-12 с добавлением IL-3, ILGF-1 в течение 7-10 суток для элиминации провоспалительной гранулоцитарной составляющей и увеличения популяции новых молодых некоммитированных клеток иммунной системы (предшественники лимфоцитов), ответственных за регуляцию репаративных процессов в тканях организма. Метод комплексной терапии был применен у 3 больных - добровольцев, страдающих коксартрозом. Прекультивированные клетки в количестве 20 млн вводили в область капсулы поражённого сустава. Оценку результатов клеточной терапии поражённого сустава проводили по объективным и субъективным критериям через каждые 2 недели, а инструментальные методы применяли через 6 месяцев после введения клеток. Субъективное улучшение было констатировано у двоих больных со второй степенью коксоартроза: уменьшение болевого синдрома, улучшение двигательной активности. У одного из них улучшились объективные показатели - увеличение углов сгибания и отведения. У одного больного с третьей степенью коксоартроза положительная динамика не была выявлена.  Есть данные, показывающие перспективность более раннего применения клеточной терапии ОА, создающей условия для адекватной регенерации хрящевой ткани в поражённом суставе (Крашенинников и др. 2005).

Повышение эффективности лечения артритов может быть достигнуто за счет применения методов, которые стимулируют регенерацию хрящевой ткани и способствуют восстановлению поврежденного суставного хряща. В НИИТиИО на модели воспалительного повреждения суставного хряща были исследованы возможности восстановления поврежденного суставного хряща путем трансплантации в полость сустава предифференцированных в хондробластоидном направлении аутологичных стромальных стволовых клеток костного мозга (Шиманский и др. 2005).

Трансплантация хондроцитов рассматривается как потенциально возможный метод лечения, и исследуются несколько возможных источников хондроцитов. Многослойные хрящевые конструкции, сделанные с использованием хондроцитов из телячьего коленного хряща, повторяют структуру и характеристики роста нормального хряща. На следующих страницах приводятся также примеры использования аутологичных хондроцитов. Дифференцированные аутологичные клетки получают путем биопсии соответствующей ткани. Выполнялись инъекции предварительно выделенных и размноженных в лаборатории аутологичных хондроцитов в место дефекта хряща. Недостатки такой процедуры очевидны: ограниченная доступность клеток, травмирование места извлечения донорской ткани, ограниченные возможности пролиферации и дифференцировки. Новые стратегии сосредоточены на трансплантации или мобилизации in situ мезенхимальных предшественников или стволовых клеток (Schutz et al 2000).

 

Один из современных методов аутотрансплантации называется мозаичной пластикой. Хирург берет несколько цилиндрических костно-хрящевых биоптатов из одной точки колена и, когда наберет достаточно материала, переносит их в пораженный участок, формируя в этом месте мозаику. Этот метод лечения подобных болезней вскоре может стать новой технологией тканевой инженерии. Оптимальным для лечения поврежденного коленного хряща может быть замещение его аутологичным суставным хрящом.

 

 

Гораздо более изящный подход - взять очень маленький биоптат и использовать эти клетки как основу для получения в культуре большого количества аутологичного материала через несколько недель. Получив достаточный объем ткани, ее можно имплантировать в место дефекта. Первой компанией, применившей эту стратегию, была Genzyme Tissue Repair; она создала основанный на аутологичных культивированных хондроцитах коммерческий продукт, который называется Carticel. Лечение представляет собой трехэтапную процедуру, в начале которой должны быть получены клетки. Их культивируют и размножают in vitro. Как только удается получить достаточный объем, их имплантируют в место повреждения. Но  при этом берется лоскут надкостницы, и  имплантированные в коленный сустав клетки прикрывают этим лоскутом. Такой способ оказывается намного более эффективным. Однако широкому распространению этого метода мешает недостаточное количество клинических данных и высокая стоимость. Одна из отрицательных сторон описанной процедуры - отсутствие хорошего носителя для клеток. С одной стороны, при таком методе требуется дополнительный этап иссечения лоскута надкостницы; с другой стороны, клетки после трансплантации лучше механически закрепляются на нужном месте.

 Genzyme Tissue Repair обладает исключительной всемирной лицензией и связанными с ней правами интеллектуальной собственности, которые включают технологию получения трансплантата аутологичных хондроцитов (Autologous Chondrocyte Graft (ACG) technology) путем выращивания заранее сформированной хрящевой ткани на двумерной поверхности производства Sentron Medical, Inc. Заранее сформированный хрящевой трансплантат - самый значительный этап в разработке Genzyme Tissue Repair продукта следующего поколения - Carticel II. Carticel  используется в операции на открытом колене и включает собственные хрящевые клетки пациентов, которые залечивают поврежденный хрящ в коленном суставе со стороны бедренной кости. Эти клетки инъецируются под мембрану надкостницы, которая берется с большой берцовой кости и пришивается на хрящевой дефект, чтобы удерживать клетки на месте, пока из них не вырастет прочная хрящевая ткань. Ожидается, что Carticel II будет иметь ряд преимуществ перед использующимся в настоящее время Carticel, в том числе возможность имплантации при процедуре артроскопии и отказ от использования надкостницы, которое делало необходимым открытую хирургическую операцию на колене. Кроме того, поскольку эта заранее сформированная хрящевая ткань уже зрелая и окружена хрящевым матриксом, Carticel II значительно уменьшит время реабилитации пациента и даст возможность хирургам лечить более обширные и тяжелые дефекты. Genzyme Tissue Repair также ожидает, что технология ACG позволит лечить дефекты хряща не только коленного, но и других суставов, в том числе плеча, локтя, лодыжки и запястья. Следующее поколение искусственных трансплантатов будет включать культивированные хондроциты и трансформирующие факторы роста, которые вызывают более быстрое размножение клеток и накопление внеклеточного вещества.

Ожидается, что при лучшем подходе будут использоваться свойства синтетических соединений, которые смогут высвобождать диссоциированные клетки, в данном случае хондроциты, в организме реципиента таким образом, что это приведет к формированию функциональной ткани. Одна из компаний, использующих подобный подход - IsoTis. Ее специалисты получают аутологичные хондроциты, размножают их и высевают клетки на носители из синтетических материалов.

Группы ученых в других учреждениях работают с аллогенными клетками или иммортализованными линиями хондроцитов. Преимущество таких подходов - в отсутствии необходимости получать аутологичный материал, а главный недостаток - в аллогенности клеток и связанных с ней рисках иммунного отторжения, переноса инфекций и т.п.

 

 

Повреждения межпозвонковых дисков - одна из главных причин связанных с работой заболеваний. Повторные травмы, нагрузки и процессы старения ведут к дегенерации межпозвонковых дисков. Когда наружное соединительнотканное кольцо диска становится ломким и хрупким, внутреннее желатиновое ядро может выдаваться (протрузия диска) и оказывать давление на нерв, что делает необходимым хирургическое удаление диска.  Хирургическое вмешательство при болезни поясничного отдела позвоночника у некоторых пациентов приводит к синдрому ослабленного позвоночника. Причинами этого синдрома могут быть неадекватная хирургия или послеоперационные осложнения. У таких пациентов продолжаются боли в спине, несмотря на удаление поврежденного диска. У некоторых пациентов происходит слияние позвонков (корпородез, спондилодез), но боли остаются. Таким образом, техника хирургических операций на позвоночнике при протрузии межпозвонковых дисков все еще нуждается в совершенствовании.

Трансплантация аутологичных хондроцитов в межпозвонковые диски начинается там, где кончается традиционная хирургия. Хондроциты межпозвонкового диска выделяются при микрохирургической процедуре и размножаются в интегрированном изоляторе фирмы Codon AG in Teltow, Germany. Повреждение диска моделировали на  животных; аутологичные хондроциты размножали в культуре и возвращали в диск при минимально инвазивной процедуре через 12 недель. Клетки оставались жизнеспособными и сохраняли способность к пролиферации после трансплантации (Ganey et al 2003). Трансплантированные хондроциты диска вырабатывали внеклеточный матрикс, строение которого было подобно строению нормальной ткани межпозвонковых дисков. При измерении изменений толщины диска, связанных с различными методами лечения, была обнаружена статистически значимая корреляция между трансплантацией клеток и возвращением к нормальной толщине диска. Эти результаты показывают, что трансплантация аутологичных хондроцитов технически выполнима и биологически существенна для восстановления поврежденных дисков и обращения процессов дегенерации диска.

Таким методом в Германии было пролечено несколько пациентов. Пока изменение высоты межпозвонковых дисков, также как и степень улучшения состояния пациентов и стабильность неповрежденных позвонков, еще изучается. В 2002 году в Германии и Франции начаты многоцентровые контролируемые клинические испытания, названные Eurodisc-Study.

 

 

Повреждение коленного хряща - одна из самых обычных травм в спорте, особенно в футболе и хоккее. Распространенный в наше время метод лечения  - хирургическое удаление оторвавшихся фрагментов хряща и, где возможно, сохранение как можно большего количества хрящевой ткани. Процедура выполняется методом артроскопии. Хотя результаты в общем неплохие в смысле уменьшения боли и восстановления функции сустава, но если часть хряща утрачена, остаются долговременные эффекты и могут произойти дегенеративные изменения сустава.

Было разработано несколько методов для стимуляции регенерации хряща в месте дефекта. Облегчить симптомы могут в некоторых случаях такие процедуры, как выделение (debridement), промывание (lavage), микропереломы (microfracturing), сверление подхрящевой кости (subchondral bone drilling) и абразивная артропластика (abrasion arthroplasty), но все они не могут восстановить гиалиновый суставной хрящ. Регенерирующая ткань, которая формируется в ответ на эти процедуры, состоит из волокнистого хряща и не обладает биомеханическими и биохимическими свойствами гиалинового суставного хряща. Компания ReGen Biologics Inc (Franklin Lakes, NJ) выпускает коллагеновый имплант мениска (Collagen Meniscus Implant), представляющий собой рассасывающуюся коллагеновую подложку, применяющуюся для восстановления и регенерации ткани мениска. Он продается в Австралии и в Европе и проходит клинические испытания в США. В таблице представлены некоторые технологии восстановления ткани и трансплантации хондроцитов, разработанные для лечения повреждений коленного хряща.

 

 

 

 

Ученые из Cornell University, New York, проводили двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, при котором лошадям для имитации тендинита вводили коллагеназу. Из жировой ткани, которую брали из области основания хвоста животных,  в лаборатории Vet-Stem Inc выделяли стволовые клетки, которые через 10 дней после повреждения сухожилия трансплантировали в место повреждения. Через шесть недель после этого лошадей умерщвляли. У тех лошадей, которым трансплантировали клетки, были получены статистически значимые отличия от контрольной группы:

·       Противовоспалительный эффект

·       Значительные улучшения в структуре и большая однородность коллагеновых волокон

·       Значительное увеличение волнистости, видимой в поляризованном свете, свидетельствующее о нормальном строении коллагена с поперечными межмолекулярными связями

·       Улучшения заживления сухожилий

 

 

Многие современные методы лечения ран могут помочь большинству пациентов с хроническими язвами  и незаживающими ранами, но есть и значительное число больных, для которых эти методы неэффективны. Для улучшения заживления ран таким пациентам необходимы заменители кожи. Одним из важных приложений клеточной терапии является регуляции восстановления тканей при трансплантации клеток на раневую поверхность. Специально подготовленные для заживления ран клетки могут способствовать минимизации образования рубцов после хирургических вмешательств или повышать скорость заживления хронических ран.

При хирургическом вмешательстве на любой ткани потребуются восстанавливающие клетки и основа (подложка) как для введения в рану клеток, так и для поддержания тканеспецифичного биосинтеза. Вдобавок, индуцирующие и фенотип-специфичные факторы роста и цитокины могут последовательно взаимодействовать с имплантированными клетками и их потомством для эффективного завершения тканеинженерной перестройки функциональной ткани. Мезенхимальные стволовые клетки - другие кандидаты на использование для улучшения заживления ран.

Во взрослой коже каждый волосяной фолликул содержит запас стволовых клеток (the bulge), которые могут быть мобилизованы для регенерации новых фолликулов в каждом цикле жизни волоса и для реэпителизации эпидермиса при заживлении ран. Исследователи из университета Рокфеллера (Rockefeller University) выделили стволовые клетки из кожи мыши и показали, что они могут самообновляться и после трансплантации мышам дифференцироваться в кожу и функционирующие волосяные фолликулы (Blanpain et al 2004). Эти открытия означают, что в конечном итоге для регенерации кожи и волос можно будет использовать аналогичные человеческие клетки, которые исследователи в настоящее время стараются выделить.

 

 

Клеточная терапия - многообещающий метод, конечная цель которого - замещение или восстановление сильно поврежденных тканей культивированными клетками. Несколько компаний разрабатывают продукты для лечения ран с большими потерями кожи.

Чтобы заменить утраченную кожу у пациентов с тяжелыми ожогами, использовали человеческие эпидермальные клетки, выращенные ex vivo на мышиных клетках (Dapolito and Auchincloss 2000). Для лечения венозных язв на ногах одобрен к применению Apligraft (Organogenesis Inc) - двухслойный заменитель кожи, сделанный из живых человеческих клеток - эпидермальных кератиноцитов и дермальных фибробластов.

Композитная культивированная кожа (Ortec International) состоит из коллагенового субстрата с фибробластами и эпидермальными клетками. Она полностью готова к употреблению, но в ограниченных количествах. В последующей аутотрансплантации кожи нет необходимости.

Новый клеточный продукт для заживления ран EpiDex (IsoTis SA) включает клетки, полученные из аутологичных предшественников кератиноцитов из наружного чехла корня (Outer Root Sheath (ORS)) волосяных фолликулов пациентов. Клетки, полученные из нескольких выдернутых у пациента волосков, через шесть недель культивирования в лаборатории могут вырасти в несколько маленьких кусочков кожи. Эти маленькие кусочки помещают на рану пациента, и они способствуют ее заживлению. Компанией IsoTis разработан эквивалент кожи EpiDex для лечения плохо заживающих хронических язв, образовавшихся из-за болезней сосудов или из-за диабета. Преимуществом ORS является то, что его основа - собственные клетки пациента, полученные при простой и неинвазивной процедуре выдергивания волос. Эта процедура проводится амбулаторно и не требует госпитализации, в отличие от процедуры получения кожи для аутотрансплантации. Из клеток, полученных при выдергивании одного волоса можно вырастить достаточное для нескольких процедур количество ткани. Этот продукт полностью прошел клинические испытания. В 2002 году он получил от FDA обозначение Humanitarian Use Device (устройства для человеческого применения).

Культивированный аутографт,  в состав которого входят стволовые клетки, может быстро и на долгое время закрыть большую поверхность тела. В регенерации участвуют два основных типа клеток: стволовые клетки кератиноцитов и транзитные размножающиеся клетки. Стволовые клетки кератиноцитов представлены in vivo небольшой популяцией, они обладают большим пролиферативным потенциалом и их потомки проходят окончательную дифференцировку. Больше присутствует в коже транзитных размножающихся клеток, потомков стволовых клеток, имеющих высокую скорость пролиферации, но лишь в течение ограниченного промежутка времени. Кератиноциты взрослых легко получить и размножить  in vitrо, и эти клетки -подходящие объекты генотерапии.

Компанией Xgen Corporation (San Carlos, CA) разработана технология, по которой на основе суспензии мышиных h-клеток культивируют человеческие клетки двух типов - дермальные фибробласты, формирующие коллагеновые волокна соединительной ткани, и эпидермальные кератиноциты. Затем клетки рассортировывают по типам и воссоздают дерму и многослойный эпидермис человеческой кожи. Xgen Corporation также сделала заявку на патент метода выращивания кожи в чашке Петри из взятого у пациента кусочка кожи, который измельчается до отдельных клеток. Затем клетки по особой технологии рассортировывают на отдельные слои и воссозданную кожу трансплантируют пациенту. Добавление теломеразы к культивированным клеткам позволяет им неограниченно размножаться  in vivo. Этот одноэтапный процесс будет также более дешевым и быстрым, чем применяющиеся в настоящее время композиционные технологии конструирования кожи из отдельных слоев.

 

 

Новым решением в лабораторном выращивании клеток из маленького кусочка кожи пациента стал CellSpray® (Clinical Cell Culture). CellSpray®  разбрызгивается на раневой поверхности, чтобы обеспечить быстрое ее закрытие эпидермисом, способствовать заживлению и оптимизировать рубцевание. Уникальная технология культивирования дает возможность получить большое количество жизнеспособных клеток из маленького биоптата за значительно меньшее время, чем по традиционным технологиям культивирования. Эта технология может быть использована для:

·       Больших ожогов и повреждений ткани

·       Исправления крупных рубцов для улучшения внешнего вида и функций кожи.

·       Крупных кожных дефектов, как гигантские невусы

Преимущества:

·       Ускорение заживления ран и улучшение качества рубцевания.

·       Уменьшения времени культивирования до пяти дней от момента биопсии.

·       Биопсия меньшего количества ткани, чем требуется обычно.

·       Надежное сцепление с раной.

·       Минимальное время аппликации и простота в обращении.

CellSpray® был использован более чем для 1500 пациентов во всем мире для лечения различных повреждений ткани. Обычно используется при ранах, занимающих более 30% поверхности тела и может быть без дополнительного лечения использован при поражениях на неполную глубину или в сочетании с технологией дермальной реконституции для лечения глубоких или на полную толщину дермальных поражений.

Недавно для удовлетворения потребности в клетках кожи при ожогах 10-30% поверхности, а также для других ран, требующих срочного лечения,  был разработан CellSpray® XP. При использовании патентованного метода получения клеток (Clinical Cell Culture's proprietary cell harvest process), CellSpray® XP может быть в течение 48 часов подготовлен к применению для лечения:

·       Ожогов среднего размера

·       Крупных ожогов, требующих экстренного лечения

·       Кожных дефектов, таких, как гигантские невусы

·       Болезней кожи, связанных с нарушением пигментации, например, витилиго

·       Грубых рубцов

Преимущества:

·       Ускоряет заживление ран и улучшает качество рубцов

·       Уменьшает необходимое время культивирования до 48 часов от момента получения биопсии

·       Маленькая биопсия из определенного места

·       Надежное прикрепление к поверхности раны

·       Минимальное время и простота манипуляций

 

Была продемонстрирована способность стромальных МСК стимулировать неоангиогенез в зоне повреждения, например, при трансплантации этих клеток на поврежденную поверхность кожи. Был использован генно-инженерный метод доставки в клетки in vitro рекомбинантного  делецированного аденовируса, в составе генома которого  присутствует ген  Lac-Z из E Coli. Ген Lac-Z кодирует фермент ß-галактозидазу, наличие которого выявлялось при добавлении субстрата Х-Gal. С помощью этого генно-инженерного метода были получены доказательства того, что аллогенные фибробластоподобные клетки костного мозга, трансплантированные на поверхность ожоговых ран, сохраняли свою функциональную активность в зоне трансплантации в течение 3 недель (Расулов и др. 2002). Проведенные в НИИТиИО исследования показали, что темп заживления ожоговых ран у мышей-реципиентов, которым были трансплантированы МСК, был достоверно выше, чем у мышей без применения клеточной терапии. Это объясняется как секрецией этими клетками пептидов-регуляторов восстановительных процессов, так и  ускоренной пролиферацией этих клеток в очаге повреждения, что показано подсчетом меченых геном зеленого флюоресцирующего белка (GFP) трансплантированных МСК (Расулов 2005). Проведенное морфологическое изучение процесса заживления ожоговых ран показало, что в контрольной серии экспериментов без использования клеточной терапии до 3 суток включительно преобладали деструктивные процессы с большим количеством некротизированных тканей, кровоизлияний, выраженной воспалительной клеточной инфильтрацией и отеком. Только к 7 суткам описанные патологические изменения уменьшались в объеме и появлялись  морфологические признаки заживления раны в виде формирования молодой грануляционной ткани. Использование фетальных фибробластов для лечения ожоговых ран в значительной степени способствовало уменьшению выраженности деструкции тканей, воспалительной клеточной инфильтрации и более ранней (на 3-и сутки) активации фибробластов, а к 5 суткам молодая грануляционная ткань с вновь образованными и функционирующими капиллярами была уже  представлена в области раны. Наиболее положительные результаты получены в опытах  с применением аллогенных МСК. Даже через 1 сутки после их нанесения на поверхность раны можно было видеть начальные признаки активации репаративных процессов, а через 3-е суток молодая грануляционная ткань была уже  хорошо представлена; она была пронизана большим количеством вновь образованных капилляров, содержащих в своих просветах кровь (Василенко и др. 2005).

В опытах на животных в НИИТиИО было показано, что СК КМ, трансплантированные в очаг повреждения мышечной ткани, начинают принимать активное участие в репаративных процессах. Под влиянием СК происходит торможение заместительной (склерозирующей) регенерации и  активируются процессы репаративной (восстановительной) регенерации тканей. Стромальные клетки костного мозга оказывают значительное влияние на течение воспалительного процесса в поврежденной скелетной мышце: тормозят образование фиброзной капсулы вокруг мембраны и ее биодеградацию, активно способствуют миграции клеток лимфоидного ряда в очаг воспаления. Стромальные клетки костного мозга, обработанные 5-азацитидином, стимулируют ангионеогенез в поврежденной скелетной мышце. Это позволяет рекомендовать применение СК КМ для лечения острого инфаркта миокарда, при ожогах, травмах с целью уменьшения активности образования рубцово-измененных тканей и создания условий для репаративно-регенерационных процессов (Потапов и др. 2005).

В НИИТиИО на крысах изучали регенерацию глубоких ожоговых ран при трансплантации аллогенных и аутогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и эмбриональных фибробластов на ожоговую поверхность. Показано, что трансплантация аллогенных и аутогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, а также трансплантация эмбриональных фибробластов уменьшают клеточную инфильтрацию раны, ускоряют новообразование сосудов и образование грануляционной ткани в ране по сравнению с контролем (ожоговые раны без трансплантации клеток). Процессы регенерации ран были наиболее выражены при использовании фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, особенно аутогенных, что подтверждалось достоверно более высоким темпом сокращения площади ожоговой поверхности. Заживление ран при использовании фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и эмбриональных фибробластов сопровождалось длительным функционированием клеток, трансплантированных на поверхность ожоговых ран (по окраске на р-галактозидазу при использовании генетической метки в аденовирусном векторе). Высказано предположение, что ускоренная регенерация ожоговых ран при использовании фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга обусловлена их меньшей дифференцированностью по сравнению с эмбриональными фибробластами. Была продемонстрирована способность стромальных МСК стимулировать неоангиогенез в зоне повреждения при трансплантации  этих клеток на поврежденную поверхность кожи (Шумаков и др. 2003).

Трансплантация аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток (ФМСК) костного мозга на глубокие и поверхностные ожоговые раны кожи уменьшает клеточную инфильтрацию ран и ускоряет новообразование сосудов. Выделяемые этими клетками вещества (ростстимулирующие факторы, тканеспецифические пептиды и др.) диффундируют внутрь раны и способствуют их более быстрому по сравнению с ожоговыми ранами, леченными традиционными методами (без трансплантации клеток). Описаны два наблюдения за ожоговыми больными (первая больная - ожог IIIБ ст. площадь 30%; второй больной -  ожог IIIА ст. площадь 10%).Изучение особенностей процесса заживления ран при использовании аллогенных стволовых клеток костного мозга подтвердило высокий темп регенерации ран, обусловленный резко выраженным неоангиогенезом. Это позволило у больной с IIIБ ст ожога на 4 сутки после трансплантации ФМСК на ожоговую поверхность осуществить успешную аутодермопластику (АДП), а также отметить более высокий темп заживления донорских зон (Расулов и др. 2003). Другой группой исследователей ускоренное восстановление клинико-морфологических показателей получено у больных после трансплантации стромальных клеток аллогенного костного мозга на поверхность глубоких ожоговых ран (Березин и др. 2005). Описано наблюдение за больной с обширным ожогом кожи (ожог I-II-III АБ степени общей площадью 40%, площадь IIIБ степени 30%), у которой лечение включало трансплантацию аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (ФМСК) на поверхность с глубоким термическим поражением. Изучение особенностей процесса заживления ран при использовании аллогенных ФМСК подтвердило высокий темп регенерации ран на фоне резко выраженного неоангиогенеза (Расулов и др. 2005).

Для лечения послеоперационных ран при операциях на дистальном отделе прямой кишки применяли эмбриональную ткань - достигнуто ускорения репаративных процессов и сокращения сроков заживления ран (Кузьминов и др. 2005).

 

 

Было показано, что при использовании в лечении ран генетически модифицированных для повышенного выделения тромбоцитарного фактора роста (PDGF (platelet-derived growth factor)) кератиноцитов увеличивается толщина соединительной ткани, формирующейся под трансплантатом. Такие заменители кожи более всего похожи на устройства для введения лекарств, причем клетки синтезируют и выделяют терапевтические белки.

Проводилось исследование с целью определить воздействие виральной вставки, несущей ген LacZ, и выполненной при помощи нового аденовируса (AdRGD), на выживание трансплантированных в кожу мышиных аллогенных фибробластов (Radfar et al 2000). На модели мышиной кожи было показано, что трансдуцированные AdRGD клетки не иммуногенны и их выживаемость в первые семь дней после трансплантации не зависит от типа клеток и иммунокомпетентности реципиента. Эта работа показала осуществимость генной терапии для лечения ран.

 

 

Трансплантация стволовых клеток от донора с хорошими глазами пациенту с повреждениями глаз - вариация трансплантации роговицы. Эти клетки - из лимба, кольца вокруг роговицы. Эти клетки восстанавливают поверхность роговицы, эпителия толщиной в 50 микрон, чтобы сохранялась ее прозрачность. Пересадка даже небольшого кусочка лимба может привести к восстановлению прозрачного эпителия и сохранению его прозрачности, таким образом восстанавливая поврежденное зрение. Эти клетки покрывают даже трансплантированную роговицу. Часто при повреждениях роговицы, захватывающих эпителий и более глубокие слои, последовательно выполняются операции трансплантации роговицы и стволовых клеток. В настоящее время реконституция роговицы при использовании соматических стволовых клеток стала хорошо отработанной операцией.

Для восстановления роговицы используется выращенный в культуре из лимбальных стволовых клеток аутологичный эпителиальный лист. Такая технология применяется в San Raffaele Hospital (Milan, Italy). Этот метод дает надежду пациентам, утратившим зрение в результате химических ожогов и тяжелых микробных инфекций. Для выращивания трансплантата используются собственные стволовые клетки пациента, полученные из лимбальной области здорового глаза. Клетки культивируют на фибриновом субстрате, выращивают лист роговицы и пересаживают его в поврежденный глаз. При использовании лимбального биоптата площадью всего в 1 мм возможно вырастить достаточно ткани, чтобы закрыть всю роговицу; возможно также лечение тяжелых билатеральных травм, если хотя бы в одном глазу сохранился маленький участок неповрежденного лимбального эпителия. Такая процедура проводилась в различных странах мира, в том числе в Иране и в Индии.

Для ослепших на оба глаза пациентов через 5 лет трансплантация стволовых клеток остается эффективной только в половине случаев, в основном из-за отторжения. Используются донорские клетки из банка глаз или от родственников, и пациентам необходима постоянная профилактика отторжения. Кроме того, при некоторых болезнях (аниридия, или отсутствие радужной оболочки, синдром Стивена Джонсона, аллергическая реакция на лекарства, глазной рубцовый пемфигоид) часто повреждаются более глубокие слои роговицы, и для восстановления зрения требуется несколько операций.

Биоинженерная ткань поверхности глаза, содержащая эпителиальные стволовые клетки роговицы и клетки-предшественники на носителе из человеческого фибринового/фибронектинового геля были использованы для конструирования ткани, трансплантируемой для восстановления поверхности глаза (Han et al 2002). Использование новой системы CryoSeal FS System (Thermogenesis Corporation) дает преимущество стерильного приготовления этих компонентов мобильного инструмента в закрытой системе за час времени.

 

 

Хирурги будущего смогут немедленно закрывать разрезы при помощи высокоскоростной струи живых клеток. Создавая устройства для хранения специфических клеток разных тканей и лазерные механизмы стрельбы, ученые из Naval Research Laboratory (Washington, DC) надеются когда-нибудь суметь моментально восстанавливать любую ткань, будь то кожа, мышцы, нервы или кость. Ключ к успеху ученых лежит в умении выращивать слои клеток нужной ткани на пропитанных питательными веществами полосах полимерного геля. Пока еще удается создать не более трех слоев, но в принципе возможно выращивание мозаичных листов из различных клеток, например, эпителиальных, нервных и мышечных, для восстановления любой ткани. Альтернатива этому - плюрипотентные клетки, способные к развитию в клетки нескольких типов, которые могут быть использованы вместе с рядом биохимических стимулов из определенных тканей, при помощи чего клетки будут индуцироваться к формированию нескольких различных тканей, составляющих сложный орган. Для размещения этих клеток ученые применяют модифицированную технологию, называющуюся пульсирующим лазерным испарением матрикса, в настоящее время применяющуюся для записывания микроскопических рисунков схемы на миллиметровых электронных устройствах. Клетки хранятся в полосах полимерного геля прямо под поверхностью, подобно ленте пишмашинки поверх бумаги.  Пятна этих «клеточных чернил» затем выбиваются при помощи импульсов света от точно сфокусированного лазера. Поскольку лазер слишком слаб, чтобы повредить клетки, его пульсация заставляет клетки вылетать из ленты со скоростью 50 миль в час и с силой в 10000 раз большей, чем нужна, чтобы пробить кирпичную стенку. Каким-то образом клетки выживают. После этого сурового испытания получающие питательные вещества клетки продолжают расти и делиться. К настоящему времени ученые сумели перенести на гель-мишень человеческие остеобласты, мышиные мышечные и крысиные сердечные клетки. 

 

 

Уже получены обнадеживающие результаты в восстановлении стареющей кожи людей при использовании различных технологий. Для коррекции глубоких морщин и изменившихся с возрастом контуров лица были использованные аутологичные культивированные фибробласты, восстанавливающие белки кожи (Boss et al 2000). После культивирования клеток, полученных из маленького кусочка кожи пациента (обычно берут биопсию позади уха), размноженные фибробласты инъецируют в нужный участок лица. Аутологичные культивированные фибробласты можно сохранять в жидком азоте для дальнейшего использования. Таким образом можно обрабатывать морщины, складки, шрамы, неровности от акне и лазерные ожоги. Эту процедуру прошли примерно 2000 человек в Европе и США, и большинство были удовлетворены улучшением своей кожи.

Этот метод запатентован компанией Изолаген (Isolagen Inc) и 3 марта 2004 года прошел первую часть III фазы клинических испытаний, результаты которых статистически достоверно показали его безопасность и эффективность.  Первые результаты показали эффективность в 77% случаев, когда применялся метод Изолаген, против 36% в группе плацебо-контроля. В 2005 году этот метод стал коммерчески доступным. Метод применяется как дополнительный к инъекциям ботулотоксина и бычьего коллагена. Однако механизм его действия не совсем понятен. Что происходит с клетками после того, как они инъецированы и встроились в свое новое окружение, кроме того, что они воздействуют на состояние кожи в этом месте, точно неизвестно. В культуре возможно выделить самые жизнеспособные клетки, имеющие относительно длинные теломеры и хорошую способность к воспроизводству, но с возрастом таких клеток становится у человека все меньше. Терапия при помощи живых клеток по технологии Изолаген имеет то преимущество, что клетки могут быть сохранены для дальнейшего использования.

 

 

Инженерные ткани и органы нуждаются в подложках, которые будут служить временной основой для роста и размножения клеток. В качестве таких подложек для выращивания и размножения клеток, кроме синтетических полимерных материалов,  хорошие возможности показали такие натуральные неклеточные материалы, как малая кишечная подслизистая, внеклеточный матрикс пузыря и амниотическая мембрана. Эти естественного происхождения биополимерные подложки содержат активные факторы роста и структурные белки и обеспечивают благоприятную окружающую среду для нормального клеточного роста, дифференцировки и накопления клеток и дополнительного внеклеточного матрикса. Это важный компонент тканеинженерных материалов для трансплантации, поскольку он обеспечивает быструю интеграцию с тканями реципиента при минимальном воспалении, что принципиально важно для успеха трансплантации. Существуют два различных подхода к использованию этих материалов, заключающиеся или в имплантации неклеточных подложек или в имплантации подложек, засеянных культивированными клетками. Во многих случаях, описанных в этой главе, клеточная терапия соединяется с тканевой инженерией. В этом разделе приведены примеры с особенным акцентом на восстановление тканей.

 

 

Были разработаны клеточные технологии восстановления и регенерации тканей ротовой полости. Было показано, что в ответ на повреждение зубы минерализуются, а их стволовые клетки расположены вокруг кровеносных сосудов. Эти клетки были идентифицированы как миофибробластоидные перициты (Murray and Garcia-Godoy 2004). Для разработки терапевтических методов, которые могли бы более эффективно решать стоматологические проблемы, изучаются возможности контролировать дифференцировку и пролиферацию этих клеток.

С перспективой постепенной утраты зубов сталкивается множество людей. Например, может происходить деградация дентина в результате кариеса или болезней периодонта, повреждения в результате несчастного случая или хирургического удаления зубов при удалении опухоли на челюсти. В США и Великобритании к 50 годам люди теряют в среднем 12 зубов из полного набора в 32. С утратой зубов связаны проблемы с пищеварением, здоровьем и внешним видом. Ясно, что технология, которая сможет предложить альтернативу искусственным зубам в виде выращенных из собственных клеток пульпы пациента и трансплантированных живых зубов,  значительно улучшит индивидуальное качество жизни.

Национальные Институты здоровья (National Institutes of Health (NIH)) разработали новую технологию, по которой возможно инженерным путем создать здоровый живой зуб на основе собственных клеток пациента, полученных из пульпы одного или двух зубов мудрости. Эта технология основана на открытии стволовых клеток пульпы зубов, которые при определенных условиях культивирования могут быть индуцированы к формированию кальцифицированных утолщений in vitro; и было показано, что in vivo они дифференцируются в структуры, состоящие из дентина и пульпы.

Ученые из королевского колледжа (Kings College (London, UK)) разработали технологию, позволяющую выращивать новый зуб на месте утраченного. Технология включает получение стволовых клеток у пациента, обработку и выращивание этих клеток в лаборатории. Затем их имплантируют под десну в тот участок челюсти пациента, где был утраченный зуб. Ожидается, что примерно через два месяца там вырастет полностью сформировавшийся живой зуб. Технология была проверена на мышах; теперь ученые исследуют, насколько успешно будет выращивание зубов из стволовых клеток, полученных из различных частей организма, например, из стволовых клеток костного мозга или СК самих зубов. В июне 2004 они получили грант в 887500$ на продолжение своих работ и создали для этого частную компанию Odontis. Испытания на людях планируются в ближайшие два года, но методика станет доступна для широкого использования не раньше чем через пять лет. Цена этой процедуры должна быть не выше современной цены синтетического импланта - 2660-3550$. Преимущества естественно выращенного зуба перед синтетическим имплантом: 

·       Живой зуб может сохранять здоровыми окружающие ткани намного лучше, чем искусственный протез.

·       Живые зубы могут соответствовать прикусу пациента

 

 

Травмы или болезни глаз могут привести к сильному помутнению роговицы и потере зрения в результате полной утраты эпителиальных стволовых клеток роговицы. Альтернативой аллотрансплантации может быть трансплантация аутологичных стволовых клеток роговицы, не требующая иммуносупрессии, но во многих случаях она невозможна - например, если в результате болезни происходит утрата стволовых клеток роговицы на обоих глазах. Для реконструкции поверхности роговицы и восстановления зрения у пациентов с двусторонними тяжелыми поражениями роговицы могут быть использованы листы из аутологичных клеток слизистого эпителия ротовой полости (Nishida et al 2004).

 

 

Недержание мочи может быть вызвано несколькими причинами. Это обычно для пожилых людей, но может встречаться также и у детей. Недержание мочи при стрессе, педиатрическое урологическое нарушение, происходит из-за недостаточности внутреннего сфинктера - тяжелый вариант стрессового недержания, обусловленный унаследованной или приобретенной недостаточностью  механизма уретрального сфинктера. Часто эту болезнь лечат, увеличивая при помощи коллагена объем шейки мочевого пузыря. Использующийся стандартный материал - коллаген - биодеградирует в течение 3-19 месяцев, и для поддержания эффективности требуются повторные инъекции. Было показано, что наращивание ткани при помощи трансплантации аутологичных хондроцитов уха,  дает значительное снижение  степени тяжести недержания у этих пациентов. Гель для инъекций был получен при смешивании выделенных из хряща и размноженных в культуре хондроцитов с альгинатом кальция. В пилотных испытаниях на 32-х пациентах, страдающих стрессовым недержанием мочи, был проверен препарат на основе клеток - Chondrogel (хондрогель), минимально инвазивный продукт для наращивания ткани (Bent et al 2001). В целом при оценке степени недержания по комплексу показателей результаты исследований показали успех разовых эндоскопических инъекций хондрогеля более чем у 80% пациентов в последующие 12 месяцев. Это также показывает, что материал  данного продукта устойчив к разрушению или миграции, поскольку благоприятный эффект сохранялся в течение года. Хондрогель достиг III фазы клинических испытаний лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса, но сообщений о дальнейшем развитии исследований пока нет. Проводящиеся в Институте Восстановительной Медицины McGowan (Pittsburgh, РА) работы станут основой клинического применения в клеточной уромиопластике стволовых клеток, выделенных из мышц.

Большой проблемой является также замещение эпителиальной выстилки урогенитального тракта. Было показано, что полученные из смывов мочевого пузыря и размноженные in vitro уротелиальные клетки дают популяцию клеток, которые могут  быть размножены в лаборатории и представляют собой удобный источник материала для тканевой инженерии пузыря (Fossum et al 2003).

 

 

В тканевой инженерии кровеносных сосудов сложность заключается  в маленьком диаметре сосудов трансплантата, использующегося в операции коронарного шунтирования. Ключевым моментом для  замещающих кровеносных сосудов является источник клеток. Важно обеспечить внутреннюю «эндотелиоподобную» выстилку, контактирующую с текущей по сосуду кровью. Для сборки ex vivo функциональных аутологичных трансплантатов сосудов были выделены и размножены в культуре зрелые клетки эндотелия и гладкой мускулатуры животных. Перенос этой технологии на создание человеческих аутологичных трансплантатов ограничивается трудностью наращивания зрелых клеток сосудов для пациентов с заболеванием кровеносных сосудов. 

  Ученые Университета Квинсленда (Brisbane, Australia) вырастили в брюшной полости «сконструированную» артерию из клеток того же животного, которому  впоследствии ее трансплантируют. Эти заменители артерий, выращенные вокруг изымаемых трубок, состоят из антигенно приемлемых функциональных живых клеток и выстланы слоем нетромбогенных клеток. Исследование, в котором облученной самке мыши делали пересадку костного мозга от самца той же породы, показало, что на поверхности трубок в течение первых пяти дней после имплантации были видны миофибробласты, изначально происходившие из гемопоэтических клеток самца-донора и, таким образом, скорее всего, из перитонеальных макрофагов. Данное исследование повышает вероятность того, что в брюшной полости могут быть выращены артерии определенной длины и диаметра.

  Мультипотентные стволовые клетки, которые легко получить из взрослых тканей, также могут быть полезны при реконструкции сосудов. Ученые Baylor College of Medicine (Houston, Texas) выделили из костного мозга, а также из скелетной мускулатуры особую популяцию взрослых стволовых клеток и исследовали их возможность давать начало клеткам сосудистого эндотелия in vivo во время вызванной повреждением неоваскуляризации. Показано, что клетки тщательно очищенной популяции взрослых стволовых клеток служат гемопоэтическими предшественниками, которые  могут принимать участие в восстановлении сосудов после повреждения (Hirschi and Goodell 2001). Стволовые клетки, которые предпочтительно внедряются в эндотелий и гладкую мускулатуру сосудов, будут чрезвычайно полезны при конструировании слоев кровеносных сосудов для применения в тканевой инженерии сосудов.

 

 

Применяющиеся в настоящее время для устранения дефектов сердца синтетические материалы не способны к росту по мере роста ребенка и не сокращаются синхронно с сердцем. Для решения данной проблемы компания Genzyme и хирурги Генерального Госпиталя Торонто (Toronto, Canada) сконструировали способную к ритмичным сокращениям «заплатку», посеяв in vitro фетальные кардиомиоциты на биодеградируемой подложке. Желатиновая заплатка была использована на крысах для замены участка правого желудочка. Посеянные клетки выживали после растворения подложки через 12 недель с момента имплантации. Кроме того, незасеянные клетками «заплатки» стимулировали врастание внутрь фиброзной ткани по мере рассасывания подложки и оставались полностью эндотелиализированными. Планируются клинические испытания аутологичного биоинженерного сердечного трансплантата.

 

 

Желательными качествами клеток для тканевой инженерии являются:

·       Для большей эффективности клетки должны быть легко доступны.

·       Они должны хорошо размножаться без потери своей возможности давать начало новым функциональным тканям.

·       Они не должны отторгаться реципиентом и превращаться в раковые

·       У них должна быть способность выживать в гипоксическом окружении при хирургической имплантации

Зрелые взрослые клетки не соответствуют многим из этих критериев. При увеличении метаболической активности возрастает потребность клеток в кислороде. После неоднократного  размножения в инкубаторе в течение длительного времени у клеток довольно значительные потребности в кислороде и они не могут нормально функционировать в условиях гипоксии в месте трансплантации.

Хотя было показано, что эмбриональные стволовые клетки (ESCs) могут эффективно превращаться практически в любой тип клеток организма, нет исследований, в которых была бы показана возможность контролируемо производить клетки только одного типа. Недостатки ESCs для тканевой инженерии:

·       ESCs будут восприниматься как чужеродные и отторгаться тканями организма реципиента.

·       ESCs нельзя заставить производить клетки только одного нужного типа.

·       Моральные и этические противоречия вокруг применения ЭСК

·        

Поэтому внимание было сосредоточено на клетках-предшественниках и столовых клетках (СК). Взрослые стволовые клетки на самом деле могут представлять собой клетки-предшественники, которые могут превращаться в клетки  определенной ткани, но не в любой тип клеток организма. Взрослые стволовые клетки могут быть получены от того же пациента, который нуждается в новой ткани, и поэтому не будут отторгаться. Поскольку эти клетки незрелые, они смогут выживать в среде с низким содержанием кислорода.

Взрослые стволовые клетки, именуемые «спороподобными» клетками, существуют фактически в каждой ткани организма (Vacanti et al 2001). Эти маленькие клетки размером от 3 до 7 µм способны выдерживать неблагоприятные условия, например,  низкое содержание кислорода в среде. Множество взрослых стволовых клеток и клеток-предшественников могут быть потомством одной и той же спороподобной стволовой клетки. По мере развития и созревания эти клетки приобретают способность превращаться  фактически в любой тип клеток организма. Считается, что спороподобные взрослые стволовые клетки - это естественные ремонтные клетки организма, активизирующиеся при повреждениях. Когда они активированы, эти запрограммированные на созревание и восстановление поврежденной ткани клетки начинают размножаться. Если повреждение достаточное большое, эти клетки могут потерять локальную связь с окружающей средой и оставаться в фазе быстрого размножения без созревания. В таком состоянии они могут переродиться в раковые. Эти крошечные спороподобные клетки достаточно малы, чтобы разноситься по лимфатической системе, образуя метастазы. Это может объяснить естественные процессы заживления и неправильного заживления. Несмотря на эти ограничения, спороподобные клетки являются многообещающими кандидатами для использования в тканевой инженерии.

 

 

Хотя стволовые клетки могут быть успешно применены при создании простых органов, получать из них анатомически сложные органы трудно. В попытке построить сложную структуру органа in vitro из аутологичных взрослых стволовых клеток, человеческие МСК выращивали в эмбрионах грызунов, чтобы дать им возможность дифференцироваться в подходящей среде развития (Yokoo et al 2005). Сочетание выращивания  целого эмбриона и следующего за ним выращивания органа дает толчок экзогенным человеческим МСК к дифференцировке и участию в  функционировании сложных структур нового типа.