Биохимия пиявок

ГИАЛУРОНИДАЗА
Гиалуронидаза - фермент, катализирующий реакции гидролитического расщепления и деполимеризации гиалуроновой кислоты и родственных ей соединений - кислых мукополисахаридов. Этот фермент широко распространен в живой природе: в ядах змей и пауков, экстрактах семенников человека, у некоторых бактерий, в экстрактах пиявок. Гиалуронидаза определяет приспособительную особенность пиявок к питанию кровью. Как известно, гиалуронидаза служит так называемым фактором распространения, изменяющим степень гидратации тканей, транспорт воды и различных ионов. Она облегчает проникновение в организм различных веществ, увеличивая проницаемость тканей, стенок капилляров в результате деполимеризации и расщепления гиалуроновой кислоты - одного из компонентов основного вещества соединительной ткани, выполняющего роль цементирующего агента, который скрепляет отдельные тканевые элементы и клетки. Можно предположить, что гиалуронидаза - тот вектор, с помощью которого другие биологически активные вещества, входящие в состав секрета слюнных желез медицинских пиявок, проникают в организм «хозяина» при насасывании крови пиявкой.

ГИСТАМИНОПОДОБНОЕ ВЕЩЕСТВО
Гистаминоподобное вещество содержится в секрете слюнных желез пиявок. Поскольку в литературе отсутствуют сведения о природе этого вещества, трудно судить о его биологической роли при гирудотерапии. Однако, как отмечалось выше, в месте приставления пиявок наблюдается типичная воспалительная реакция. Очевидно, такое проявление местного действия секрета пиявок можно отнести на счет гистаминоподобного вещества.

ГИРУДИН
В 1884 г. из экстракта пиявок Хайкрафт впервые выделил вещество, замедляющее свертывание крови, позднее названное гирудином. До открытия гепарина экстракты из головной части пиявок широко использовались в качестве антикоагулянта. В 40-х годах Кирсанов и Быстрицкая получили препарат гирудина-сырца. Очищенный гирудин был впервые выделен Марквардтом на основе разработанного им метода фракционирования экстракта из головной области медицинской пиявки. В опытах in vitro и in vivo было показано, что гирудин, будучи специфическим ингибитором фермента тромбина, образует с тромбином неактивный прочный нековалентный стехиометрический комплекс с константой диссоциации 6,3·10-13 М. Исключительно высокая специфичность гирудина по отношению к тромбину выгодно отличает его от других природных ингибиторов этого фермента: антитромбина Ш, гепарина и a2-макроглобулина. По сравнению с рядом синтетических ингибиторов тромбина, гирудин представляет собой идеальный ингибитор этого фермента.
Ингибирование активности тромбина, проявляющееся в замедлении или полном блокировании свертывания фибриногена - не единственная функция гирудина. В его присутствии замедляется реакция активации тромбином факторов свертывания V, VIII, ХIII. Гирудин препятствует реакции высвобождения и агрегации тромбоцитов, ингибируя связывание тромбина кровяными пластинками. Гирудин вызывает диссоциацию комплекса тромбина со специфическими белками - рецепторами на тромбоцитах, так как у тромбина сродство к гирудину выше, чем к высокоаффинным рецепторам на тромбоцитах. Он лишает тромбин способности повышать антикоагуляционный и фибринолитический потенциалы крови.
Наблюдается удлинение тромбинового, частичного тромбопластинового и протромбинового времени плазмы крови. Эти показатели системы свертывания крови нормализуются по мере выведения гирудина из организма. Количество тромбоцитов, уровень фибриногена и фибринолитическая активность плазмы не изменяются. Не отмечено влияния гирудина на кровяное давление, частоту сердцебиений и дыхания.
Окисление дисульфидных связей приводит к потере антитромбиновой активности гирудина. Химическое модифицирование свободных карбоксильных групп в гирудине резко снижает его сродство к тромбину. Это свидетельствует о том, что при комплексообразовании гирудина с тромбином реализуются ионные взаимодействия между молекулами.

ПСЕВДОГИРУДИН
При выделении гирудина из цельных медицинских пиявок ему сопутствует неактивный компонент из туловищ пиявок, названный псевдогирудином. В отличие от гирудина, содержащего на N-конце изолейцин, псевдогирудин содержит на N-конце валин. 
По аминокислотному составу псевдогирудин несколько отличается от гирудина. Гирудин характеризуется более высоким содержанием аспарагиновой и глутаминовой кислот, лизина, изолейцина и тирозина. Содержание цистеина в псевдогирудине в 3 раза ниже, чем в гирудине.

БДЕЛЛИНЫ
Бделлины - ингибиторы трипсина и плазмина - впервые были обнаружены в 1969 г. в коммерческих препаратах гирудина, которые обладали способностью ингибировать амидолитическую активность плазмина и трипсина.

ЭГЛИНЫ
Эглины впервые обнаружены в составе коммерческих препаратов гирудина наряду с бделлинами. Они представляют группу полипептидов с молекулярной массой 6600-6800 D. Эглины ингибируют a-химотрипсин, субтилизин и нейтральные протеазы гранулоцитов человека: эластазу и катепсин G и образуют с этими протеазами прочные комплексные соединения с константами диссоциации ~ (2-3)· 10-10 М. 
Эглины получены в чистом виде, и их состав и физико-химические свойства достаточно хорошо изучены. В первичной структуре эглина С насчитывается 70 аминокислотных остатков, особенность их заключается в отсутствии дисульфидных связей и остатков метионина, изолейцина и триптофана.

ДЕСТАБИЛАЗНЫЙ КОМПЛЕКС
Дестабилаза e-(g-Glu)-Lys изопептидаза впервые была обнаружена в составе секрета слюнных желез Hirudo medicinalis в 1986 году. Фермент осуществляет свою фибринолитическую (тромболитическую) активность посредством гидролиза изопептидных связей, образуемых при стабилизации фибрина в присутствии фактора XIII свертывания крови, обусловливая нетрадиционный механизм фибринолиза.
Дестабилаза способна образовывать агрегаты, которые благодаря липидному компоненту могут изменять свою пространственную ориентацию. В пользу этого свидетельствует тот факт, что дестабилаза проявляет свои свойства (т.е. гидролиз изопептидных связей) как в водных, так и в органических растворителях. Образуемые в растворе агрегаты дестабилазы, приобретают свойства мицеллы, способной в зависимости от физико-химических свойств растворителя менять свою пространственную ориентацию, экспонируя или гидрофильную, или гидрофобную части своей структуры.
Однако противотромботический потенциал дестабилазы трудно объяснить лишь блокадой агрегации тромбоцитов, обусловленной аналогом простациклина - липидным компонентом дестабилазы. При анализе влияния дестабилазы на параметры свертывания крови показано, что в ее присутствии значительно удлиняются тромбиновое время и время рекальцификации плазмы крови. Естественно предположить, что подобное действие обеспечивается гирудином и ингибитором калликреина плазмы крови, которые и были обнаружены в препаратах дестабилазы.
Обращает на себя внимание тот факт, что всем препаратам дестабилазы, выделенным различными методами, а также подвергнутым электрофорезу в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, гельфильтрации через Sephadex G-50 и G-75, термической обработке, щелочному гидролизу, экстракции органическими растворителями, сопутствует активность гирудина и ингибитора калликреина плазмы крови.
Дестабилаза представляет собой довольно прочный комплекс, содержащий дестабилазный и простагландиновый компоненты, гирудин и ингибитор калликреина плазмы крови, который можно назвать "дестабилазный комплекс". О прочности этого комплекса свидетельствует тот факт, что распространенными методами биохимии разрушить его не удается. Естественно, что профилактический антитромботический эффект дестабилазы обусловлен как блокадой внутреннего механизма свертывания крови (ингибирование адгезии и агрегации тромбоцитов и активности калликреина плазмы крови), так и антитромбиновой активностью гирудина.
Проникновение дестабилазного комплекса в кровь осуществляется двумя механизмами: обычный транспорт по межклеточным контактам (пассивный перенос) и трансмембранный (активный перенос) транспорт, т.е. через мембрану клеток за счет встраивания в структуру мембраны. А это возможно для такого высокомолекулярного комплекса лишь в том случае, если он обладает свойствами липосомы. Возможность дестабилазного комплекса менять свою пространственную ориентацию в зависимости от природы растворителя наглядно демонстрируется при анализе активностей компонентов комплекса при переходе из водной фазы в органическую и наоборот. В водной фазе все компоненты дестабилазного комплекса проявляют свою активность, тогда как в этилацетате только активность дестабилазы (амидазная) и простагландина (блокада агрегации тромбоцитов); при обратном переводе комплекса в водную фазу проявляют свою активность все компоненты. Таким образом, способность дестабилазы агрегировать в мицеллы, а также связывать гирудин и ингибитор калликреина обеспечивают дестабилазному комплексу свойства и структуру липосомы.
Весь гирудин и ингибитор калликреина плазмы крови находятся в связанном состоянии, т.е. в составе липосомы, и лишь в бактерии-симбионте пиявок эти вещества находятся в свободном состоянии. 
Выделить компоненты дестабилазного комплекса в гомогенном состоянии возможно лишь в результате разрушения полипептидной цепи дестабилазы. В этом случае освобождаются простагландиновый компонент дестабилазы, гирудин и ингибитор калликреина плазмы крови.
Характеристика простагландинового (липидного) компонента дестабилазы: 
подобно простациклину ингибирует агрегацию тромбоцитов, стимулированную тромбином, Са2+-ионофором, АДФ, арахидоновой кислотой. Обладает гипотензивным действием, как при внутривенном, так и при оральном введении спонтанно гипертензивным животным.Гирудин выделен в гомогенном состоянии. Его активность и поведение соответствуют гирудину, выделенному по методу Марквардта.
Характеристик
а ингибитора калликреина плазмы крови. Особый интерес представляет ИК, который в свободном состоянии проявляет свойства, не обнаруживаемые в составе липосомы (ДК). В результате разрушения липосомы ИК проявляет способность ингибировать трипсин.
Таким образом, дестабилаза, представляющая собой прочный белок-липидный комплекс, обладает высокой агрегационной способностью. В результате агрегирования мономеров дестабилазы образуется мицелла, способная менять свою пространственную ориентацию в зависимости от природы растворителя или контактирующего субстрата, - экспонируя при этом или гидрофильную, или гидрофобную части своей структуры. В результате контакта с кровью мицеллярная структура дестабилазы связывает свободные гирудин и ингибитор калликреина плазмы крови, образуя липосому, которая в водных растворителях проявляет активность всех компонентов ДК (т.е. дестабилазы, аналога простациклина, гирудина и ИК), тогда как в органических растворителях демонстрирует активность лишь дестабилазы и аналога простациклина. Мономерной формой липосомы является фракция ДК с ММ 25 kD. 
Подобная структурная организация ДК обеспечивает не только стабилизацию входящих в его состав компонентов, но и облегчает проникновение их путем активного переноса через мембрану клетки (трансмембранный перенос) как при внутривенном, так и пероральном введении экспериментальным животным.
Липосомальная природа ДК обеспечивает и важную физиологическую роль этого комплекса, как универсального тромболитического агента: быстрое проникновение ДК через мембрану клетки, прикрепление за счет липидного компонента дестабилазы к поврежденному участку сосудистой стенки и к пристеночному тромбу, медленный лизис фибринового сгустка за счет изопептидазной активности дестабилазы и препятствование дальнейшему тромбообразованию за счет блокады тромбина, калликреина плазмы крови, агрегации и адгезии тромбоцитов. Таким образом, природная липосома - ДК является агентом, обеспечивающим как профилактическое противотромботическое, так и тромболитическое действие.
Гидрофильная часть дестабилазы связана с цепями гирудина и ИК, которые аллостерически модифицируют активный центр дестабилазы и формируют в пространстве участок связывания с лизином. Связывание ИК и дестабилазы происходит в области связывания субстратов активных центров. Активный центр дестабилазы находится в непосредственной близости от липидной части молекулы, что обеспечивает проявление активности в разнополярных растворителях.
Учитывая изложенное выше, можно сделать следующее заключение. БАВ, продуцируемые медицинскими пиявками, обеспечивают:
противотромботическое действие, т.е. блокируют тромбоцитарно-сосудистое и плазменное звенья внутреннего механизма свертывания крови, а также плазменное звено гемостатического процесса на более поздних стадиях его развития и таким образом, препятствуют тромбообразованию; 
тромболитическое действие; интересен механизм растворения тромбов: БАВ воздействуют только на сформировавшиеся ("старые") фибриновые сгустки, в которых полимеры фибрина прошиты изопептидными связями. Существует гипотеза, что дестабилазный комплекс адсорбируется и на новообразующихся ("молодых") тромбах, стимулируя их прочное закрепление на сосудистой стенке и быструю стабилизацию; и лишь впоследствии начиная плавное растворение сформированного тромба; 
гипотензивное действие, вернее "нормотензивное" действие; обусловленное, в первую очередь, низкомолекулярными веществами простагландиновой природы, кстати, впервые обнаруженными в медицинских пиявках. Парадоксальность подобного воздействия определяется тем, что БАВ, продуцируемые медицинскими пиявками, приводят к норме повышенное или пониженное значения артериального давления. Механизм действия в настоящее время изучается, однако, можно предположить, что снижение давления обусловлено стабильным аналогом простациклина, повышение же - веществами, обладающими кининазной активностью (природа этих веществ в настоящее время не идентифицирована); 
репаративное воздействие на поврежденную стенку кровеносного сосуда; восстановление атромбогенной поверхности кровеносного русла; 
антиатерогенное действие; БАВ активно вмешиваются в процессы обмена липидов, приводя его к нормальным условиям функционирования, снижают уровень холестерина и триглицеридов в крови, обеспечивают регресс атероматозных бляшек; 
антигипоксическое действие; т.е. повышение процента выживаемости в условиях пониженного содержания кислорода (гипоксия), что является немаловажным фактором для вынашивания плода при беременности, осложненной рядом патологических процессов; 
иммуностимулирующее действие; активизация защитных функций организма обеспечивается воздействием на уровне системы комплимента; отмечено также и повышение фагоцитарной активности крови после сеанса гирудотерапии, что обеспечивает противовоспалительное действие пиявок, наряду с ингибиторным (по отношению к эластазе, катепсину G и другим нейтральным протеазам гранулоцитов) потенциалом; 
аналгезирующее действие; обезболивание, как в месте постановки пиявок, так и общеорганного действия. 
Конечно, что этот список не охватывает всего спектра физиологического действия БАВ, продуцируемых медицинскими пиявками, но в достаточной степени характеризует то комплексное воздействие, которое возможно ожидать от продуцируемых ею БАВ в составе косметических средств.