Снова о стволовых клетках

В истории науки и техники Россия упоминается реже, чем следовало бы. Первый в мире телевизионный приемник сделан у нас, но многие искренне верят, что телевидение пришло из США; радио изобретено Поповым, но считается, что его открыл Маркони; даже Игорь Сикорский, получивший образование в нашей стране, сначала эмигрировал, а затем создал первый в мире вертолет. Та же судьба постигла открытие, которое признают третьим по значимости в естествознании после открытия двойной спирали ДНК и расшифровки генома, - о наличии в живых организмах так называемых стволовых клеток. Автор этого открытия, сделанного задолго до двух первых, - русский ученый Александр Александрович Максимов (1874-1928), он же предложил и термин «стволовая клетка», когда рассказывал о своих исследованиях на Первом Международном гематологическом съезде в Берлине в 1908 году. Открытие Максимова поначалу не получило признания мировой науки, и в дальнейшем Россия уступила приоритет в исследовании и медицинском использовании стволовых клеток. Однако оно послужило основой для яростных споров, смелых и порой безрассудных экспериментов, единичных успехов и строгих запретов на протяжении всего ХХ века. 

Где найти стволовые клетки? 

Термин «стволовая клетка» Максимов предложил, чтобы объяснить механизм быстрого самообновления клеток крови. Каждые сутки в крови человека завершают свой жизненный путь миллионы клеток, и им на смену приходят новые популяции эритроцитов и лейкоцитов. Анализируя темпы возобновления этих клеток, Максимов понял, что этот процесс должен отличаться от описанного к тому времени клеточного деления, иначе костный мозг при его ограниченных размерах был бы не в силах справиться с этой гигантской работой. Он предположил, что в системе кроветворения должны участвовать клетки-предшественники, которые образуются в костном мозге и служат основой для получения разнообразных клеток крови.

Исследования Максимова позже продолжил профессор московского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Гамалеи А.Я.Фриденштейн. В 1976 году он опубликовал сообщение о том, что при культивировании клеток, содержащихся в вытяжке костного мозга, селезенки и некоторых других тканей, они превращаются в фибробластоподобные клетки. Продолжение экспериментов показало, что из таких первичных тканевых клеток могут образовываться предшественники жировых клеток и остеоцитов. Стволовые клетки мезенхимальных тканей (то есть соединительных, костных, жировых и мышечных), из которых путем дифференцировки можно получить клетки других тканей, Фриденштейн так и назвал мезенхимальными. Особенно важным оказалось то, что стволовые клетки-предшественники могут превращаться не только в клетки крови, но и в клетки других тканей. Дело в том, что мезенхимальные стволовые клетки, в отличие от кроветворных, способны прилипать к поверхности и образовывать сообщества, дающие начало тканевым структурам.

Одновременно с Фриденштейном британский ученый Роберт Эдвардс (позднее получивший известность совместными с Патриком Степто работами по экстракорпоральному оплодотворению, которые в 1978 году привели к рождению Луизы Браун - первого ребенка из пробирки. -  Примеч. ред. ) изучал свойства стволовых клеток эмбриональной ткани. В 1968 году он вместе со своим учеником Ричардом Гарднером ввел стволовые клетки эмбрионов крысы развивающимся зародышам мыши, вырастив первое животное-химеру. В конце 80-х годов в нескольких лабораториях были выделены и исследованы стволовые клетки различных тканей человека, а в самом конце ХХ века в США получены поддерживаемые культуры стволовых клеток эмбриональной ткани приматов (Джеймс Томсон и соавт.).

В настоящее время известны следующие источники стволовых клеток человека:

1. Стволовые клетки тканей плода (плюрипотентные, то есть способные превращаться в ткани - производные любого из зародышевых слоев, в отличие от большинства мультипотентных стволовых клеток взрослого организма, возможности которых ограничены):

- клетки опухоли - эмбриональной карциномы, которые при культивировании превращаются в стволовые;

- эмбриональные герминальные клетки (то есть такие, из которых получаются половые клетки взрослого организма);

- эмбриональные стволовые клетки (получаемые из внутренней клеточной массы бластоцисты).

2. Стволовые клетки взрослого организма (соматические):

- кроветворные;

- стромальные (мезенхимальные);

- мышечные;

- нейральные;

- эпидермальные и др.

Активнее всего исследуются кроветворные и эмбриональные стволовые клетки. В то же время довольно много стволовых клеток обнаруживается в составе жировой ткани взрослого человека (об этом интересном факте мы еще поговорим подробнее).

В опытах на животных было показано, что при введении стволовых клеток в организм они сами находят пути к больному органу и, встраиваясь в его ткани, восстанавливают и его структуру, и функции. Поразительные результаты получены на животных, перенесших инфаркт миокарда или ишемию головного мозга и получавших лечение эмбриональными стволовыми клетками. Стволовые клетки способны трансформироваться также в клетки печени, поджелудочной железы и других органов. Складывалось впечатление, что они могут стать незаменимым материалом для «ремонта» организма при любых видах заболеваний.

Казалось, существует только одна проблема - в источнике «материала» для ремонта. В эмбриональных тканях человека стволовых клеток очень много. Но уже к 20 годам жизни их количество уменьшается до одной на 10 000, а к 50 годам - до одной на 500 000 клеток. К преклонному возрасту, когда люди главным образом и нуждаются в лечении, стволовых клеток в организме уже практически не остается. Таким образом, возникает вопрос о том, где взять эти клетки.

Применение эмбриональных тканей животных едва ли решит этот вопрос. Безоговорочный успех омолаживания с помощью пересадки половых органов или экстрактов тканей молодых животных существовал лишь в научно-фантастической литературе (см. «Собачье сердце» М.А.Булгакова), и современная наука скептически относится к подобным перспективам.

Для получения «человеческих» стволовых клеток можно использовать пуповинную кровь, собираемую при родах. Недавно продемонстрировано наличие стволовых клеток в менструальной крови. Источником этих клеток может быть и абортивный материал (человеческие эмбрионы), но этот вариант сопряжен с понятными нравственными проблемами.

Попавшие в прессу разрозненные сообщения о неэтичных действиях сотрудников некоторых клиник стали одной из причин, по которой Конгресс США наложил запрет на все исследования стволовых клеток в государственных учреждениях Соединенных Штатов. Опыт, однако, показал, что этот запрет тормозил развитие исследований, но не решал этических проблем, так что с приходом в администрацию США нового президента Барака Обамы запрет был снят. Исследование стволовых клеток и создание протоколов их использования для лечения пациентов интенсивно финансируют как государственные, так и частные фонды Европы, Китая и Америки.

Но существуют и другие проблемы, которые нельзя преодолеть административным решением. Так, выяснилось, что введенные в организм эмбриональные стволовые клетки способны провоцировать образование опухолей. Поэтому их применение для лечения человека должно находиться под строгим контролем.

Перспективы применения стволовых клеток в медицине 

Что касается нашей страны, участники недавнего научного совещания по стволовым клеткам (Москва, 2007) были единодушны: необходимо преодолеть отставание, развивать исследования стволовых клеток и разрабатывать безопасные протоколы для лечения различных заболеваний человека (особенно тех, в отношении которых медицина пока бессильна), но все это должно происходить под контролем специальных этических комитетов. В последнее время академики В.Н.Покровский, В.А.Ткачук, В.Н.Смирнов, Н.П. Бочков возглавили различные направления исследований стволовых клеток и доказывают необходимость строгого контроля, осуществляемого специалистами, - как лабораторных исследований, так и применения стволовых клеток в лечении различных болезней. С 2004 года в нашей стране издается специальный научный журнал «Клеточные технологии в биологии и медицине», где публикуются результаты исследования стволовых клеток.

Возможность практического применения стволовых клеток впервые была продемонстрирована в 50-х годах ХХ века, когда группа немецких ученых сообщила, что с помощью трансплантации костного мозга как источника стволовых клеток можно спасти животных, получивших смертельную дозу радиоактивного облучения. Позже А.Кохер c соавторами (Университет Колумбии) продемонстрировали, что введение крысам с экспериментальной ишемией миокарда кроветворных стволовых клеток человека предотвращает отмирание кардиомиоцитов в зоне повреждения, а Бенджамин Рейбинофф с соавторами (университетская больница Хадасса в Иерусалиме) показали, что при трансплантации эмбриональных стволовых клеток человека в желудочек головного мозга мыши они дифференцируются в нейроны.

Осторожные исследователи пока не выходят за пределы эксперимента, но уже наметились впечатляющие успехи. В лаборатории академика РАН и РАМН В.А.Ткачука в МГУ имени М.В.Ломоносова изучается возможность применения стволовых клеток для стимуляции роста сосудов. Сотрудники Ткачука показали, что прорастание сосудов в ткани, нуждающиеся в улучшении кровоснабжения, резко ускоряется благодаря стволовым клеткам. Возможно, это упростит многие проблемы, возникающие при пересадке органов и тканей, например поможет обеспечить скорейшее создание общего кровеносного русла пересаженного органа с организмом пациента.

Накопленный к концу ХХ века экспериментальный материал позволил надеяться на успешное применение стволовых клеток для лечения таких тяжелых болезней, как цирроз печени, гепатиты, инсульты, сахарный диабет, псориаз, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, паркинсонизм, хорея Гентингтона, наследственные болезни крови и лимфопролиферативные заболевания, иммунодефицитные состояния, некоторые врожденные нарушения метаболизма. Разрабатываются подходы к использованию стволовых клеток в терапии аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, а также заболеваний сердечно-сосудистой системы. В Интернете появились сообщения, что скоро должно завершиться клиническое испытание протокола использования стволовых клеток для лечения системной красной волчанки - не поддающегося излечению аутоиммунного заболевания. Насколько строго проводились исследования, можно будет убедиться после публикации данных в медицинской печати.

В нашей стране уникальный опыт применения стволовых клеток для лечения пациентов с различными патологиями накоплен в Центре акушерства, гинекологии и перинатологии МЗ РФ имени В.И. Кулакова. Эти пионерские работы начал академик РАМН Г.Т.Сухих еще 15 лет назад, когда он был руководителем отдела (в настоящее время он директор центра). Работа ведется в трех направлениях: терапия пациентов с глубокими нарушениями обмена при циррозе печени вследствие алкоголизма, терапия женщин с истощенной функцией яичников (неизлечимое бесплодие) и гипоксического (в том числе травматического) поражения тканей мозга. В этих клинических испытаниях, проводимых под контролем ученого совета и Этического комитета центра, применяются, как правило, аллогенные (то есть не принадлежащие самому пациенту) стволовые клетки - по мнению Г.Т.Сухих, эти клетки, получаемые из абортивного материала, обладают наибольшей силой воздействия ив то же время наименее опасны в отношении индукции онкологических процессов. О работах Г.Т.Сухих можно прочитать в его совместной монографии с В.С.Репиным (Репин В.С., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М.: БЭБиМ, 1998).

Как восстанавливать нервные клетки

Достижения нейрохимии конца ХХ века развеяли два крупных заблуждения, относящихся к работе мозга. Считалось, что нервные клетки не способны к регенерации и что взрослый мозг не содержит стволовых клеток. Оба эти утверждения в настоящее время не кажутся абсолютной истиной (интересующихся отсылаем к книге О.А.Гомазкова «Нейротрофическая регуляция и стволовые клетки мозга», М.: Икар, 2006). Трудно сказать, потому ли «нервные клетки не восстанавливаются», что среди них нет стволовых, но нельзя исключить, что стволовые клетки могли бы способствовать восстановлению деятельности мозга, поврежденного окислительным стрессом.

Окислительный стресс - это нарушение снабжения тканей кислородом, при котором скорость накопления активных радикальных соединений (радикалов кислорода, азота и хлора) превышает скорость их нейтрализации. Окислительному стрессу посвящена обширная научная и популярная литература, в которой отмечается, что ткани мозга особенно чувствительны к окислительному стрессу. Среди причин и легкая окисляемость липидных молекул, входящих в состав мембран клеток мозга, и дефицит систем антиоксидантной защиты, и накопление кислых продуктов обмена глюкозы (ацидоз) в условиях дефицита кислорода. Парадокс в том, что всплеск продукции свободных радикалов при окислительном стрессе может иметь и приспособительное значение - повышение уровня радикалов до некоторого порога помогает мозгу адаптироваться к стрессу (см. об этом статью одного из авторов в журнале «Успехи физиологических наук», 2003, 34 (3)). Но превышение порога оказывается губительным для нейронов.

Бесконтрольное развитие окислительного стресса в мозгу приводит к ишемическому поражению ткани инсульту, вызывающему гибель клеток и утрату функций высшей нервной деятельности. Инсульт стоит на первом месте среди причин инвалидизации пациентов. В большинстве случаев перенесенный инсульт ограничивает жизненные ресурсы и возможности интеллектуальной деятельности. Однако известно немного примеров, когда после глубокого инсульта больной возвращался к полноценной активности, - так, композитор Альфред Шнитке, перенеся инсульт, продолжал сочинять замечательную музыку.

Инсульт - не единственное трудноизлечимое заболевание мозга, протекающее на фоне окислительного стресса: он характерен и для болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, хореи Гентингтона. А последняя, кроме того, развивается на фоне тяжелейшего дефицита энергии, обусловленного нарушениями синтеза АТФ в митохондриях тканей мозга. Понятен интерес исследователей к применению клеточной терапии для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Но сначала необходимо решить фундаментальные проблемы. Могут ли стволовые клетки в принципе оказаться полезными? Если да, то как их доставить в поврежденный мозг через гематоэнцефалический барьер? Будут ли они действовать по принципу заместительной терапии, беря на себя функции погибших нейронов (и кто в таком случае сообщит им информацию, исчезнувшую с гибелью утраченных клеток)? Или они обеспечат стимуляцию деления и роста собственных клеток пациента, оставшихся в живых, но подавленных перенесенным стрессом? Если при этом они будут влиять на собственные нейрональные клетки пациента, синтезируя регуляторные факторы (факторы роста и т.д.), то, возможно, эти вещества следует идентифицировать, установить структуру и использовать для лекарственной терапии. 

Стволовые клетки против хореи 

Решению некоторых из этих вопросов посвящена программа совместных исследований, которую проводит коллектив специалистов Научного центра неврологии РАМН, ЗАО «РеМеТэкс» и Международный биотехнологический центр МГУ имени М.В.Ломоносова. В качестве объекта исследования была выбрана модель, близкая хорее Гентингтона. Это наследственное нейродегенеративное заболевание человека считается одним из тяжелейших, оно практически не поддается лечению. Хорея (от греческого слова « choreia » пляска) характеризуется непроизвольными, быстрыми, неконтролируемыми движениями, возникающими в различных мышцах. Диагноз «хорея Гентингтона» ставится десяти человекам из ста тысяч. Это заболевание может развиться в любом возрасте. Его причина - гибель высокочувствительных нервных клеток, расположенных в особых отделах головного мозга - базальных ганглиях. Больные чрезвычайно плохо координируют движения, у них нарушается способность к мышлению.

Частичное моделирование этой болезни возможно при систематическом введении крысам нейротоксина 3-нитропропионовой кислоты. Этот нейротоксин вызывает стойкий окислительный стресс и гибель нейронов базальных ганглиев. В результате у грызунов развиваются симптомы, напоминающие клиническую картину хореи Гентингтона у человека.

Лечить таких животных решили стволовыми клетками, выделенными из мезенхимальной жировой ткани. В подкожной жировой ткани человека содержится на удивление много стволовых клеток, и их несложно выделить. Но самое наглядное преимущество состоит в том, что, когда наука приблизится к использованию стволовых клеток для лечения человеческих недугов, можно будет изготовить стволовые клетки для каждого индивида из его собственного «материала». Таким образом, отпадут проблемы тканевой совместимости и упростятся многие этические затруднения.

Исследования проводили на лабораторных крысах, у которых вызывали подобие болезни Гентингтона внутрибрюшинным введением 3-нитропропионовой кислоты в течение недели. Перед лечением суспензию мезенхимальных стромальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, активировали по нейральному типу (то есть направляли их развитие «в сторону» нейронов), инкубируя со специальным агентом - ретиноевой кислотой. Чтобы убедиться в успешности активации, в клетках проверяли появление типичных нейрональных белков - нестина, β-тубулина и специальных глутаматных рецепторов, участвующих в молекулярных процессах памяти (рис. 1). Эти рецепторы активируются не только глутаматом, но также его синтетическим аналогом N-метил-D-аспартатом (NMDA), поэтому они называются NMDA-рецепторами. Через пять дней инкубации стволовых клеток с ретиноевой кислотой в них действительно обнаруживались вышеперечисленные нейрональные маркеры, и их можно было вводить крысам.

1. После того как стволовые клетки жировой ткани были активированы ретиноевой кислотой, у них образовались нейриты - удлиненные отростки, типичные для нервных клеток (а), а также начали синтезироваться белки-маркеры, специфичные для нейронов, - NMDA-рецепторы (б), нестин (в), тубулин beta-III (г). Верхний ряд - контроль. Появление NMDA-рецепторов в части клеток показывают новые пики флуоресценции (под черной горизонтальной линией), которых нет в контроле, а появление нестина и тубулина продемонстрировано с помощью флуоресцентно меченных антител против этих белков.

Как проверить, улучшается ли состояние крысы при введении стволовых клеток? После воздействия нейротоксина у животных ярко проявлялись когнитивные расстройства, которые оценивали как по баллам специальной шкалы неврологического дефицита, так и по способности к обучению в водном тесте Морриса (по имени впервые применившего его ученого Питера Морриса). В этом тесте, о котором «Химия и жизнь» уже не раз писала, оценивается способность крыс запоминать путь в бассейне к платформе, позволяющей избегать плавания. Вода специально замутнена, поэтому крыса не может увидеть платформу, ей приходится полагаться только на память. Уже побывавшие на платформе крысы запоминают путь и в следующий раз отыскивают ее более или менее быстро. Однако у животных, получавших 3-нитропропионат, память нарушена, и это выражается в удлинении времени поиска. 

Крысам помогло...

Даже после однократного введения стволовых клеток грызунам их неврологическое состояние заметно улучшилось (рис. 2). 

2. У крыс, получивших инъекцию 3-нитропропионовой кислоты (3-НПК), нарушается работа мозга и затем восстанавливается: 1- без дополнительных воздействий, 2- после однократного внутрижелудочкового введения активированных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК). Линия 3 показывает отсутствие нарушений у контрольных животных

Симптоматика стала менее выраженной, восстановилась способность к обучению. Улучшилась способность запоминать путь к платформе (рис. 3). Были найдены также улучшения в исследовательской активности (способность ориентироваться в незнакомом пространстве), которую анализировали в классическом тесте «открытое поле».

3. В тесте Морриса крысы, получавшие 3-нитропропионовую кислоту, искали платформу под водой гораздо дольше, чем в контроле (то есть память у них была нарушена), но при введении активированных стволовых клеток из жировой ткани человека их мозговая деятельность восстанавливалась. Вверху - типичный пример пути к платформе животных каждой группы, внизу - среднее значение времени поиска платформы (3-НПК - 3-нитропропионовая кислота, ММСК - мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки)

Более того, у крыс под влиянием лечения стала восстанавливаться форма нейронов хвостатого ядра, одного из базальных ганглиев мозга. Под влиянием токсина они вытягивались и уменьшались в размерах, а после трансплантации стволовых клеток приобретали прежние размер и форму. К тому же в исследуемой области мозга несколько возрастало соотношение между нейрональными и глиальными клетками, что соответствовало улучшению энергетического снабжения нейронов (рис. 4).

4. Размер клеток и нейроглиальный показатель (доля клеток глии в пересчете на одну нейрональную клетку), полученные при анализе срезов головного мозга у исследованных групп животных

Интересно, что наши эксперименты нашли продолжение в независимых исследованиях шведских и австралийских ученых. Они показали, что стволовые клетки способны восстанавливать функцию нейронов, поврежденных чрезмерной активацией NMDA-рецепторов. Эти рецепторы имеют двойственную природу: с одной стороны, они обеспечивают протекание молекулярных процессов, лежащих в основе запоминания, а с другой - повышают риск развития окислительного стресса (поэтому они носят название экзайтотоксических рецепторов, от англ. excitation - возбуждение и toxicity токсичность). Перевозбуждение рецепторов переводит нормальное функционирование нейронов на рельсы окислительного повреждения. Так вот, в этих условиях стволовые клетки защищают клетки мозга от экзайтотоксического эффекта NMDA. Заинтересовавшись этим феноменом, авторы выяснили, что протекторными свойствами обладает ранее не известный регуляторный пептид, и описали его структуру. Регулятором оказался пятичленный фрагмент, идентичный фрагменту молекулы инсулина (от 26 до 30 аминокислотных остатков), который они назвали пентинином. Весьма вероятно, что подобными защитными свойствами обладают стволовые клетки мозга не только у крыс, но и у других млекопитающих.

Конечно, эксперименты на животных - это лишь самое начало пути. До клинических испытаний метода пока очень далеко. Предстоят еще и проверка отдаленных последствий, и разработка способов введения клеток в мозг - всех проблем не перечислить. Перед началом клинических испытаний необходимо будет решить множество чисто научных проблем. Как быстро ученые с ними справятся, зависит главным образом от финансирования. У нас есть прекрасно подготовленная научная молодежь. Если мы сумеем убедить ее продолжить работу в этой области, нескольких лет будет достаточно, чтобы закрепить успехи отечественной науки и вернуть ее приоритет в медицине стволовых клеток.

Опасения и перспективы

К началу ХХI века различные виды лечения с помощью стволовых клеток испытали на себе более 10 000 пациентов в мире, в подавляющем большинстве случаев -с положительным результатом. Заговорили о том, что стволовые клетки могут стать основой для принципиального решения проблемы долголетия человека.

Но были и неудачи. А ученых должны настораживать даже отдельные примеры такого рода, поскольку за ними стоят человеческие жизни. На взгляд специалистов, безудержная реклама нового вида лечения слишком рано стимулировала использование стволовых клеток в практической медицине. Не накоплено достаточной экспериментальной базы, не апробированы протоколы лечения, нет материала по возможным отдаленным последствиям в экспериментах на лабораторных животных.

Самым безопасным и не требующим долговременных исследований казалось применение стволовых клеток в косметологии. Однако программа «Стволовые клетки в эстетической медицине», хотя и широко рекламируется в Интернете, грешит той же поспешностью, с которой мы пытаемся преодолеть отставание от Запада, пока что весьма заметное. Вот лишь один пример. В Екатеринбурге в 2002 году на базе фирмы «Версаль» было проведено испытание сертифицированного Минздравом России препарата фибробластов, выращиваемых в культуре in vitro (первоначальным их источником была пуповинная кровь человека). Результаты казались весьма положительными, и многие именитые пациенты (артисты, общественные и политические деятели) прибегали к помощи быстро возникающих косметических клиник, использующих стволовые клетки. Однако широкое применение этих услуг невозможно рекомендовать не только из-за их высокой цены. Слишком хорошо известны неудачные опыты лечения, испортившие судьбу и внешний вид нескольким персонам, чьи имена на слуху у общественности.

На наш взгляд, применение стволовых клеток для лекарственной терапии пока еще находится в области риска. Необходимы исследования, которые должны обезопасить пациента от случайностей, попутных осложнений, отдаленных последствий. Но остановить применение стволовых клеток не удастся. Все, что придумывало человечество, рано или поздно находило практическое применение - от ядерной энергии до модификации генома. Задача научного сообщества состоит в том, чтобы обеспечить этический контроль использования новых технологий и тем самым обезопасить науку от коммерческого давления.

Что еще можно прочитать о дифференцировке стволовых клеток в нейроны:

Введение в молекулярную медицину (под редакцией М.А.Пальцева). М.: Медицина, 2004.

Куликов А.В. и соавт. Экспрессия NMDA-рецепторов в мультипотентных стромальных клетках жировой ткани человека в условиях дифференцировки, индуцированной ретиноевой кислотой. «Клеточные технологии в биологии и медицине», 2007, № 4, с.216-220.

Faijerson J. et al. Adult neural stem/progenitor cells reduce NMDA-induced excitotoxicity via the novel neuroprotective peptide pentinin. Journal of Neurochemistry, 2009, т. 109, с. 858-866.

Tkachuk V.A. at al. Regulation of arterial remodeling and angiogenesis by urokinase-type plasminogen activator.

Can. J. Physiol. Pharmacol. 2009, т. 87, с. 231-251.