Клуб выпускников МГУ: Многоликий вирус прион

Человечество с незапамятных времен стремится проникнуть в тайны старения и смерти. И все эти долгие века в его естественном стремлении просматривается удивительное однообразие в подходах, а именно - желание связать механизм старения с ухудшением функционирования тех или иных органов или систем (в зависимости от представлений о данном органе или системе органов в конкретный исторический период времени). Именно поэтому в разные времена причиной старения считались болезни печени, сердца, легких, почек, ослабление деятельности желез внутренней секреции или системы иммунитета и т. д.

Последнее десятилетие характеризуется небывалым интересом к проблеме старения и смерти, что обусловлено заметным увеличением доли пожилых людей, особенно в экономически развитых странах. Увы, мир стареет! Но унывать не стоит. Лучше давайте-ка и мы с вами рассмотрим проблему старения с общебиологических позиций.

Давно и хорошо известно, что существует так называемая видовая продолжительность жизни. Вот несколько примеров ее весьма выраженного разнообразия:

Мышь доживает в среднем до 2,5 года

Собака. . до 12 лет

Кошка. . до 20 лет

Лев. . . до 30 лет

Корова. . до 30 лет

Шимпанзе. . до 45 лет

Слон. . . до 70 лет

Попугай. . до 70 лет

Осетр. . до 100 лет

Крокодил. . до 100 лет

Человек. . до 75 лет

Уже то, что видовая продолжительность жизни существует, позволяет прежде всего предполагать наличие какого-то механизма ее ограничения, время работы которого характерно для каждого вида.

Вместе с тем, учитывая выраженное постоянство величины видовой продолжительности жизни (есть, конечно, небольшие колебания), можно высказать второе предположение - о безусловной надежности такого механизма ограничения жизни для каждого вида (этот механизм никогда не ошибается, и можно быть уверенным, что не ошибется и впредь!).

Наконец, третье предположение, основанное на двух предыдущих: высшая степень надежности механизма ограничения жизни позволяет предполагать его определенную «простоту», которая в биологическом смысле должна подразумевать немногоступенчатость процесса.

И здесь нельзя не вспомнить слова знаменитого американского физика-теоретика, одного из основателей термодинамики Джозаий Уилларда Гиббса: «Одна из главных целей теоретического исследования в любой области знаний состоит в том, чтобы найти такую точку зрения, с которой предмет выглядит в его наибольшей простоте».

А теперь давайте вновь вернемся к внутримозговым изменениям при прионных болезнях. Их, как мы помним, отличают два главных события - гибель нейронов и размножение (пролиферация) клеток глии (глиоз), что приводит к формированию губкообразного состояния мозговой ткани и образованию амилоидных бляшек. При этом казалось само собой разумеющимся, что под действием инфекционного агента (инфекционный прионный белок) гибнут нейроны, а глиоз - не что иное, как репаративная (восстановительная) реакция соединительной ткани мозга (свято место пусто не бывает…). Ну, наподобие того, как если бы вы сильно расцарапали себе руку и на месте ранки через несколько дней образовался бы рубец. То есть логика рассуждений была такова:

И такое представление о развитии морфологических повреждений мозговой ткани при прионных болезнях существовало многие годы.

Однако эпизоотия среди крупного рогатого скота в Великобритании и особенно факт передачи возбудителя болезни коров молодым людям резко усилили интерес к проблеме прионных заболеваний. И начиная с конца 80-х годов прошлого столетия в результате многочисленных исследований было показано, что пролиферация клеток глии при прионных болезнях не только сопровождает гибель нейронов, но даже предшествует (!) данному процессу. А это здорово меняет ситуацию!

Напомню, и при прионных болезнях, и при старении гибнут нейроны и размножаются клетки глии. И если даже при прионных болезнях этот процесс начинается с пролиферации клеток глии, то в процессе старения вероятность такого начала возрастает в тысячу раз. Почему? Да потому, что при старении нет инфекционного агента, а гибель нейронов все-таки происходит. И тут возникает следующий вопрос: «Не может ли первичное размножение клеток глии стать причиной гибели нейронов?»

Вопрос не праздный, и обоснованность его связана с особенностями кровоснабжения мозговых клеток. Посмотрите на рис. 22. В отличие от всех остальных клеток организма млекопитающих, которые снабжаются питательными, строительными веществами, кислородом через плотно прилегающую стенку мельчайших кровеносных сосудов - капилляров, нервные клетки (нейроны) не прилегают к стенкам мозговых капилляров, а получают все необходимое через посредника, каковым является одна из клеток глии - астроцит (звездчатая клетка). Мало того, известно, что эта связь астроцита и с капилляром, и с нейроном очень непрочная.

^{Рис. 22. Схема связи нейрона с капилляром головного мозга}

А теперь представьте себе, что клетки глии (а это разные виды клеток, среди которых помимо клеток астроглии есть клетки микроглии, олигодендроглии и др.) начинают размножаться. Все это происходит в замкнутом пространстве (в ткани мозга), и в результате связь астроцита с капилляром с одной стороны и астроцита с нейроном с другой легко может быть нарушена, что по понятным причинам приведет к гибели нейрона от «голодной смерти».

Не сомневаюсь, что читатель, прочитав эти строки, невольно подумает: «Как хороши были бы все эти рассуждения, если бы они еще объясняли, почему в стареющем мозге клетки глии вдруг должны начать размножаться?»

Законный вопрос. И потому впервые еще 12 лет назад, т. е. в 2000 году, в статье, опубликованной у нас в стране и за рубежом, мы предположили, что в стареющей мозговой ткани со временем накапливается некое вещество (некий фактор?), которое и осуществляет запуск пролиферации глиальных клеток мозга. А год спустя в журнале «Вестник Российской академии медицинских наук» была напечатана моя статья, которая так и называлась «От прионных болезней к проблеме старения и смерти».

Замечу, что статья «пробивалась» на страницы журнала с большим трудом: ее рецензент (а им оказался не кто иной, как заместитель главного редактора журнала) был почти возмущен, что я сопоставляю два различных процесса: «прионные болезни - это патологический процесс, а старение - процесс физиологический». (Это были первое недоверие с противодействием, но не последние…) И только приведенные мною в качестве аргументов сопоставления этих двух процессов в публикациях упомянутых выше зарубежных авторов, среди которых были и лауреаты Нобелевской премии, сумели как-то успокоить рецензента. Воистину нет пророка в своем отечестве!

Итак, есть предположение о возможном существовании некоего фактора, способствующего размножению клеток глии. Но как его проверить?

Всегда наиболее убедительны простые рассуждения и простые, доступные для понимания факты. Поэтому, начиная поиск такого фактора, мы прежде всего из мозга новорожденных мышат получили культуру глиальных клеток (способ получения клеточных культур описан во второй главе книги, в разделе «Лед сломан»). Через 12 дней размножившиеся глиальные клетки разделили на три партии пробирок:

к клеткам в первой партии пробирок ничего, кроме питательной среды, не добавляли (контроль);

к клеткам во второй партии пробирок добавили экстракт мозга молодых, одномесячных мышат;

к клеткам третьей партии пробирок добавили экстракт мозга старых, полуторагодовалых мышей.

Все пробирки поместили в термостат. Периодически часть пробирок извлекали и в них подсчитывали количество выросших клеток.

Как выяснилось, экстракты мозга молодых мышат оказывают слабое, менее чем двукратное стимулирующее действие на размножение глиальных клеток, обнаруживаемое лишь к 14-му дню наблюдения. В то же время под действием экстрактов мозга старых мышей уже к 8-му дню количество глиальных клеток удваивалось, а к 11-му - учетверялось. Согласитесь, это уже кое-что!

К сожалению, опыты на таких клетках отличались большой продолжительностью во времени, так как обычно клетки, только что полученные из тканей, размножаются очень медленно. Следующие опыты проводили с использованием перевиваемых клеточных культур (о которых уже шла речь в истории шестой: «Неожиданное - рядом»).

В данной серии опытов использовали две линии клеток глиального происхождения. И вновь экстракты мозга молодых мышей практически не оказывали стимулирующего действия на пролиферацию клеток в культурах, в то время как экстракты мозга старых мышей вызывали выраженный стимулирующий эффект на клеточную пролиферацию уже начиная с 3-го дня их инкубации, увеличивая количество клеток по сравнению с контролем в 3-5 раз. Здесь было над чем задуматься!

Как-то однажды после моей лекции о прионах в Институте мозга ко мне подошла молодая женщина и, сказав, что знает о наших опытах с мозговыми экстрактами, любезно предложила исследовать их с помощью электрофореза. Это была Т. П. Клюшник - прекрасный специалист-нейробиохимик из Центра псхического здоровья РАМН.

Татьяна Павловна сравнила электрофоретическую подвижность в полиакриламидном геле мозговых экстрактов старых и молодых мышей и… не обнаружила разницы между образцами (рис. 23). Однако она на этом не успокоилась и провела сравнение обоих экстрактов в условиях так называемого изоэлектрофокусирования и… выявила различия (рис. 24, отмечено серым овалом).

^{Рис. 23. Отсутствие различий при электрофорезе в полиакриламидном геле экстрактов мозга молодых (2-месячных) и старых (18-месячных) мышей}

^{Рис. 24. Обнаружение различий между экстрактами мозга молодых и старых мышей при их изоэлектрофокусировании}

Теперь давайте разберемся, что это за исследования и о чем могут говорить их результаты. Напомню, что электрофорез в геле есть не что иное, как движение в гелевой среде молекул вещества в электрическом поле от отрицательного полюса к положительному. Понятно, что более крупные молекулы будут двигаться медленнее, нежели более мелкие. Таким образом при электрофорезе определяют возможные различия в массе молекул двух или более сравниваемых веществ. В то же время при изоэлектрофокусировании движение молекул зависит не от массы, а только от величины их электрического заряда.

Таким образом, полученные результаты также говорили, по крайней мере, о существовании различий между экстрактами мозга молодых и старых мышей.

Совершенно очевидно, что в экстрактах мозга старых мышей, в отличие от таковых у молодых животных, содержался какой-то фактор, стимулирующий клеточную пролиферацию. Но оставалось неясным, является ли данный фактор причиной процесса старения или его следствием (действительно, чего только не накапливается в голове с возрастом!).

Это решено было проверить в опытах по искусственному состариванию молодых мышей.

Использовали четыре группы мышей линии C57Black/6 (генетическая линия мышей с черным волосяным покровом):

в первую группу входили естественно постаревшие двухгодовалые мыши;

во вторую - молодые двухмесячные мыши, которым ежедневно в течение 10 дней вводили очищенные мозговые экстракты таких же двухмесячных мышей;

в третью - молодые двухмесячные мыши, которым по той же схеме вводили очищенные мозговые экстракты старых двухгодовалых мышей;

в четвертую - молодые двухмесячные мыши, которым по той же схеме вводили сыворотку крови старых двухгодовалых мышей.

Потянулось ожидание… Спустя четыре месяца, т. е. когда молодым мышам исполнилось шесть месяцев, у животных третьей группы обнаружились внешние признаки старения: вялость движений, реакции на пищу, тусклость волосяного покрова, менее плотные, с признаками поседения кончики волос.

Но этого было мало. В дальнейшем мышей вывели из опыта и известный московский патологоанатом, крупнейший специалист по количественной характеристике патологических процессов в органах и тканях профессор Г. Г. Автандилов, провел морфометрический анализ головного мозга мышей всех групп, т. е. точно подсчитал количество нейронов в одинаковых участках коры головного мозга. И вот что оказалось.

_{Результаты сравнительного исследования доли нейронов и глии в коре головного мозга молодых, старых и искусственно состаренных мышей}

Как видно из таблицы, площадь нейронов у молодых мышей, которым вводили экстракты мозга молодых же мышей (вторая группа), была наивысшей, что сочеталось с наименьшей площадью, занимаемой клетками глии. Вы спросите: зачем молодым мышам вводили мозговые экстракты также молодых? Отвечаю - чтобы исключить вероятность развития неспецифической энцефалопатии, т. е. неспецифических мозговых нарушений из-за введения мозговой ткани.

У естественно постаревших двухгодовалых мышей (первая группа) площадь нейронов была заметно меньше, а площадь глии заметно больше, чем у молодых мышей второй группы. Но самое интересное было в другом: у молодых мышей третьей группы, которым вводили экстракты мозга старых мышей и у которых проявились внешние признаки старения, площадь нейронов оказалась более чем в два раза меньше, а площадь глии - достоверно больше, чем у молодых мышей второй группы. Мало того, в коре головного мозга мышей третьей группы площадь нейронов оказалась почти в два раза меньше, а площадь глии - достоверно больше, чем в коре головного мозга естественно постаревших дыухгодовалых мышей первой группы. Наконец, заметное снижение количества нейронов и существенное увеличение количества глии наблюдали у молодых мышей, которым вводили сыворотку крови старых животных. Эти изменения были не столь ярко выражены, как у молодых мышей, которым вводили мозговые экстракты старых мышей, однако заметно более выражены, чем в мозговой коре естественно постаревших двухгодовалых мышей.

Все эти данные позволили расценивать обнаруживаемый в мозговых экстрактах и в сыворотке крови фактор, стимулирующий пролиферацию клеток глии, не как следствие, а как причину старения, что явилось основанием для его обозначения как фактор старения.

Таким образом, события, происходящие в головном мозге в процессе старения, схематически можно представить следующим образом:

Для того чтобы выяснить, когда появляется и как накапливается в ткани мозга фактор старения, были испытаны мозговые экстракты мышей разного возраста. Оказалось, что накопление данного фактора начинается примерно с 8-10-го месяца их жизни, т. е. в конце первой трети средней продолжительности мышиной жизни (запомните, пожалуйста, этот срок!), постепенно увеличиваясь с возрастом (рис. 25). Полученные результаты прямо свидетельствовали о накоплении в мозговой ткани мышей фактора, вызывающего активную гибель нейронов. Данный фактор обнаруживался и в сыворотке крови мышей также начиная с 8-10-месячного возраста.

^{Рис. 25. Накопление фактора старения в экстрактах мозга мышей разного возраста}

^{Рис. 26. Накопление фактора старения в сыворотке крови людей разного возраста}

Конечно же, обнаружив фактор старения в крови стареющих мышей, мы с помощью запатентованного нами метода предприняли первые обследования людей разного возраста. Предварительные результаты показали, что фактор старения в сыворотке крови людей можно обнаруживать начиная с 25-летнего возраста с последующим увеличением его активности (рис. 26).

Кстати сказать, недавно были опубликованы результаты 7-летних наблюдений американских ученых, которые показали, что человеческий мозг достигает пика своих возможностей к 22 годам, а в 27 лет начинается необратимый процесс старения. При этом у большинства людей признаки ухудшения памяти были зарегистрированы уже в возрасте 37 лет.

Вы удивлены? Вспомните, пожалуйста, сроки появления фактора старения в организме мышей - в конце первой трети средней продолжительности мышиной жизни. У человека 25 лет также знаменуют завершение первой трети средней продолжительности жизни. К 25 годам заканчивается программа роста, т. е. попросту мы перестаем расти. Так вот, можно предположить, что выключение программы роста включает программу старения…

Следует добавить к этому, что фактор старения был обнаружен впоследствии также в лимфоидных клетках селезенки (в результате совместной работы с известным иммунологом А. Г. Бабаевой - сотрудницей Института морфологии человека РАМН).

Возникает законный вопрос - что представляет собой данный фактор старения?

Прежде всего хотелось узнать его размеры. Для этих целей мы использовали так называемые диализационные мешки с различным размером пор, способных пропускать вещества соответствующего размера: массой 50, 25, 15 или 5 кД. Оказалось, что фактор старения свободно проходит через мешки с порами 50, 25 и 15 кД и не проходит через мешок с порами 5 кД. Следовательно, можно было предположить, что молекулярная масса нашего фактора старения соответствует величине порядка 10 кД, что позднее было уточнено Е. Н. Николаевым и В. С. Куровой в Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН с помощью времяпролетного масс-спектрометра, а именно - 10 кД.

Фактор старения оказался устойчивым к воздействию ультрафиолетовых и рентгеновских лучей, а также к переваривающему действию трипсина и к повышенной температуре, но чувствителен к протеиназе К. Кроме того, фактор обладает видовой специфичностью действия, т. е. его активность реализуется только в культуре тех же клеток, откуда он получен. Поэтому фактор старения в экстрактах мозга и в сыворотке крови мышей испытывали на клетках мышиного (ЭПНТ-5 или L-929) или крысиного (НГУК-2) происхождения, а фактор старения в сыворотке крови людей определяли на клетках человеческого происхожденеия (L-41 или U-373).

На основании полученных данных можно заключить, что фактор старения млекопитающих представляет собой небольшой белок, принципиально отличающийся от инфекционного прионного белка (по размерам и устойчивости к ферменту протеиназе К).

Надеюсь, вы обратили внимание на поразительное сходство динамики накопления фактора старения в организме мышей и людей? Это сходство позволяет предполагать определенную универсальность процесса старения у всех млекопитающих. Конечно, это явление ввиду его огромной значимости требует дальнейшего изучения, однако уже сегодня можно высказать некоторые соображения по этому поводу.

Обнаружение фактора старения не только в ткани мозга, но и в сыворотке крови, а также его резко выраженное повреждающее действие на клетки мозга в организме искусственно состаренных молодых мышей может свидетельствовать о том, что процесс старения млекопитающих не является простым «увяданием» организма, а, по всей видимости, представляет собой биологически активный процесс, в котором фактор старения играет весьма агрессивную роль.

Каков же итог? Есть гипотеза, есть экспериментальный материал, полученный как в системе in vitro (на клеточных культурах), так и в системе in vivo (на лабораторных животных), подтверждающий обоснованность гипотезы. Наконец, закономерности, установленные в результате обследования с помощью нашего метода людей, совпали с данными экспериментальных исследований лабораторных животных. Таким образом, в 2003 году нами была представлена система доказательств пусковой роли глиоза в развитии процесса старения и гибели мозга млекопитающих.

На основании совокупности полученных результатов по представлениям президента Геронтологического общества РАН члена-корреспондента РАН В. Н. Анисимова и ученого секретаря Московского отделения Геронтологического общества РАН А. В. Халявкина нами (В. А. Зуев, Г. Г. Автандилов, Н. Г. Игнатова) был получен диплом на открытие «Явление накопления в организме млекопитающих фактора старения», зарегистрированный 28 апреля 2005 года с датой приоритета 12 января 2000 года.

Казалось бы, все на своих местах. Однако открытие фактора старения не всеми было воспринято благожелательно. К сожалению, даже некоторые руководители геронтологических учреждений, к примеру, в Москве, как мне кажется, были больше огорчены, если не сказать - напуганы этим обстоятельством. По-видимому, появление надежного маркера старения мешало тем, кто опасался объективной оценки эффективности средств и методов омоложения, столь модных и широко распространенных ныне, а главное - приносящих немалые доходы. Но если бы негативное отношение к открытию ограничивалось этим. Увы! Не все наши крупные ученые «повернулись лицом» к открытию, фактически не дав ему тогда дорогу.

Однако в сентябре 2011 года произошло событие, круто изменившее ситуацию. В сентябрьском номере журнала «Nature» была опубликована статья большой (23 человека) группы авторов, главным образом из Стенфордского университета США, в которой сообщалось об обнаружении в крови старых мышей веществ, под действием которых в мозге молодых мышей снижается нейрогенез - формирование новых нейронов из стволовых клеток мозга. Количество этих веществ с возрастом увеличивается, что сопровождается снижением памяти и способности к усвоению новой информации. Авторы выявили шесть белков крови, концентрация которых повышалась в процессе старения, и первым из них оказался небольшой белок, известный как эотаксин. Увеличение содержания эотаксина было обнаружено также в крови и в спинномозговой жидкости людей в процессе их старения.

В ответ на эту публикацию президент Геронтологического общества РАН В. Н. Анисимов, давно и хорошо знакомый с результатами наших исследований, в «Вестнике геронтологического общества РАН» (2011. № 7-8) так прокомментировал работу американцев: «К сожалению, в этой интересной работе совершенно не нашли отражения опубликованные на английском языке исследования, выполненные в этом же направлении в нашей стране. А между тем более 10 лет тому назад группа под руководством проф. В. А. Зуева начала публикацию (в том числе и на английском языке) целой серии работ, результаты которых прямо свидетельствовали об обнаружениях исследователями фактора старения в организме млекопитающих, включая и человека… Более того, в 2005 г. авторами был получен патент на прижизненное определение этого фактора в организме человека». (Естественно, подобная реакция не могла не вызвать у меня чувство глубокой благодарности Владимиру Николаевичу Анисимову.)

Публикация в журнале «Nature» и данные комментарии резко изменили отношение к фактору старения и автору этих строк. На сегодняшний день просто неприлично высказывать какие-либо сомнения на этот счет. Ведь сами американцы (!) подтвердили существование фактора старения… Отсюда и поступающие мне многочисленные предложения участвовать в различного рода проектах. Действительно, нет пророка в своем отечестве!

В связи с обнаружением фактора старения часто приходится слышать один и тот же вопрос: «Сколько лет может прожить человек?» Честный ответ на него: «Неизвестно».

Но если вопрошающий будет проявлять излишнюю настойчивость, следует познакомить его с источником, уже не одно тысячелетие отвечающим на этот сакраментальный вопрос вполне конкретно: «И сказал Господь: не вечно Духу Моему быть пренебрегаемым человеками; потому что они плоть; пусть будут дни их сто двадцать лет» (Библия, Книга Бытие, 3-й стих б-й главы).

Давайте поразмышляем над числом 120. Как к нему относиться? С доверием или нет? Я думаю, что в первую очередь с удивлением! Потому, не забудьте, что Библия была написана много веков назад, а на протяжении всех времен средняя продолжительность жизни человека менялась весьма существенно. И эти изменения, как вы увидите из приведенных ниже данных, были направлены только в сторону ее увеличения:

Эпохи палеолита, неолита, Древней Греции и даже Древного Рима характеризовались малой средней продолжительностью жизни человека по целому ряду причин, и главные из них - тяжелая, чаще смертельная борьба за выживание и отсутствие сколько-нибудь эффективного санитарного и медицинского обеспечения.

Любое более или менее серьезное ранение было абсолютно смертельным. Эпидемиям чумы, оспы, холеры и другим массовым инфекционным заболеваниям противопоставить было нечего. Мало того, история Древнего мира - это история постоянных войн, сначала между племенами, а потом и между государствами.

В Средние века появляются ростки цивилизации: развиваются мореплавание (вспомните эру великих географических открытий), астрономия, медицина. В связи с этим средняя продолжительность жизни человека заметно увеличивается - на 13-17 лет, но это немного, если учесть, что рассматриваемый исторический период исчисляется примерно 15 веками.

Еще менее заметным кажется увеличение рассматриваемого показателя за период от Средневековья до середины XIX века - всего 5 лет, хотя, конечно, этот период имеет значительно меньшую временную протяженность, составляющую примерно 4-5 веков. Но зато за последующие 100 лет - от середины XIX до середины XX века - произошел очень большой скачок показателей средней продолжительности жизни человека - на 30 лет, что обусловлено не только заметным улучшением социально-бытовых условий, но главным образом поистине революционными событиями в области борьбы с инфекционными заболеваниями (вспомните эру великих микробиологических открытий): обнаружение возбудителей инфекционных заболеваний, разработка учения о предохранительных прививках (вакцинация), применение методов антисептики, а затем и асептики при проведении хирургических вмешательств, открытие антибиотиков, наконец, несомненный прогресс в разработке санитарно-гигиенических норм.

А вот за последние 50 лет продолжительность жизни человека хоть и продолжала увеличиваться, но этот рост составил всего 5 лет. Много это или мало? По сравнению с веком, который исчисляется с середины XIX до середины XX столетия, это, конечно, немного, но если сравнивать с увеличением на 13-17 лет за 15 веков, то понимаешь, что это - немалое достижение; к такому же выводу приводит сравнение с периодом от Средних веков до середины XIX века, т. е. за 500 лет.