Митохондриальная свободнорадикальная теория старения - на каком этапе мы находимся?
The mitochondrial free radical theory of ageing - Where do we stand?
Frontiers in Bioscience 13, 6554-6579, May 1, 2008
Jan Gruber, Sebastian Schaffer, Barry Halliwell
National University of Singapore, Department of Biochemistry, Centre for Life Sciences, 28 Medical Drive, 117456 Singapore
Адрес для корреспонденции: Barry Halliwell, Department of Biochemistry, National University of Singapore, University Hall, Lee Kong Chian Wing, UHL #05-02G , 21 Lower Kent Ridge Road, Singapore 119077, Tel: 656563247, Fax: 6567752207, E-mail: bchbh@nus.edu.sg
Ключевые слова: митохондрия, старение, активные формы кислорода, ДНК, антиоксиданты, митохондриальные нутриенты, мтДНК, делеции, точечные мутации, обзор
СОДЕРЖАНИЕ
1. Резюме
2. Введение
2.1. Роль митохондриальной ДНК
2.1.1. Митохондриальная ДНК, дисфункция и этиология связанных с возрастом дегенеративных процессов: предположения и вопросы
2.1.2. Является ли митохондриальный матрикс неблагоприятной средой для ДНК?
2.1.3. Обладают ли митохондрии способностью восстанавливать повреждения ДНК и депротеинизирована ли мтДНК?
2.1.4. Часто ли происходят окислительные повреждения мтДНК in vivo ?
2.1.5. Существуют ли доказательства «порочного круга»?
2.1.6. Имеют ли значение митохондрии?
2.1.7. Мозаичность - ключевой аспект патологии, ассоциированной с возрастным накоплением мутаций мтДНК
2.2. Каким образом мутации мтДНК могут послужить причинным фактором ассоциированных с возрастом нарушений функционирования тканей?
3. Аргументы в пользу направленных определяющих факторов базальной скорости старения, а не индивидуальных ассоциированных с возрастом заболеваний
4. Стратегии
4.1. Митохондриальные нутриенты
4.1.1. L-карнитин/ацетил-L-карнитин
4.1.1.1. Базовая информация
4.1.1.2. Возможные механизмы действия
4.1.1.2.1. Влияние на биоэнергетику митохондрий
4.1.1.2.2. Влияние на антиоксидантную защиту
4.1.1.3. Исследования воздействия на человека в отношении старения и ассоциированных с возрастом заболеваний
4.1.2. Коэнзим Q10
4.1.2.1. Базовая информация
4.1.2.2. Возможные механизмы действия
4.1.2.2.1. Влияние на биоэнергетику митохондрий
4.1.2.2.2. Влияние на антиоксидантную защиту
4.1.2.3. Исследования воздействия на человека в отношении старения и ассоциированных с возрастом заболеваний
4.1.3. Альфа-липоевая кислота
4.1.3.1. Базовая информация
4.1.3.2. Возможные механизмы действия
4.1.3.2.1. Влияние на биоэнергетику митохондрий
4.1.3.2.2. Влияние на антиоксидантную защиту
4.1.3.3. Исследования воздействия на человека в отношении старения и ассоциированных с возрастом заболеваний
4.2. Сравнение комбинированного и раздельного приема митохондриальных нутриентов
4.3. Антиоксиданты - немного общей информации
5. Выводы и перспективы
6. Литература
1. Резюме
Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе процесса старения, может обеспечить наилучшую стратегию решения проблем, связанных со старением населения всего мира. Одна из теорий, предлагающая такие молекулярные механизмы, сформулирована 50 лет назад. Harman et al. высказали предположение, что старение может быть опосредовано макромолекулярными повреждениями, появляющимися в результате реакций с участием активных форм кислорода (АФК). На сегодняшний день одна из наиболее популярных теорий старения - это версия свободнорадикальной теории, согласно которой митохондрии являются одновременно и источником, и мишенью АФК. Мы представляем критический обзор состояния ключевых принципов и концепций, на которых основана эта теория. Мы считаем, что существующие на настоящий момент доказательства свидетельствуют о том, что первоначальные допущения являются спорными, в то время как для изучения ряда критических моментов необходимо усовершенствовать существующие методики. Даже при этих условиях все большую очевидность приобретает тот факт, что целостность митохондрий и митохондриальной ДНК мтДНК) действительно могут быть факторами, определяющими старение организма. Мы обсуждаем возможные перспективы успешных вмешательств в этот процесс, а также свидетельства за и против эффективности существующих терапевтических подходов.
2. Введение
В 1954 Gerschman et al. высказали предположение, что свободные радикалы кислорода являются токсичными агентами, ответственными как за кислородное отравление, так и за повреждения, вызываемые гамма-облучением (1). Два года спустя Дэнам Харман (Denham Harman) впервые предположил, что эндогенные свободные радикалы могут вызывать макромолекулярные повреждения in vivo , а также то, что опосредованные свободными радикалами повреждения являются причинным фактором накопления мутаций, развития рака и старения (2).
За более чем 15 лет своего существования свободно-радикальная теория старения претерпела модификации и дополнения. Наиболее важным из них является утверждение, согласно которому, наиболее значимым источником активных форм кислорода in vivo является супероксидный радикал, синтезирующийся как побочный продукт нормального процесса окислительного фосфорилирования, и что сами митохондрии могут быть основной мишенью накопления вызываемых АФК повреждений (3-5). Это утверждение дало начало митохондриальной свободнорадикальной теории старения, вариации которой мы более детально обсудим ниже. Различные версии свободнорадикальной теории старения уже активно обсуждались другими авторами (6-10), поэтому целью данной статьи является критический обзор ряда свидетельств, считающихся подтверждающими эту теорию, а также оценка перспектив уменьшения вызываемых свободными радикалами митохондриальных повреждений.
2.1. Роль митохондриальной ДНК
Митохондриальной ДНК, из-за ее расположения в митохондриальном матриксе, уделялось особое внимание как предполагаемой мишени опосредуемых АФК повреждений, так как, по крайней мере, часть продуцируемых в митохондрии АФК высвобождается в матрикс (3,4,11-13).
Исходная версия свободно-радикальной теории старения основана на четырех принципах (6-13). Во-первых, из-за своего расположения в митохондриальном матриксе мтДНК подвержена сильному воздействию свободных радикалов. Во-вторых, в отличие от ядерной ДНК (яДНК), мтДНК депротеинизирована, то есть не покрыта защитными структурными белками, такими как гистоны. Согласно третьему допущению, митохондрии лишены способности восстанавливать вызванные окислением повреждения ДНК. Исходя из этих трех допущений, постоянная базовая нагрузка окислительных повреждений на мтДНК значительно выше, чем на яДНК.
Воздействие АФК на мтДНК способствует формированию продуктов окислительного повреждения оснований ДНК, таких как 8-гидрокси-2’-диоксигуанозин (8OHdG), а также разрывов цепочек (14-16). Некоторые из таких повреждений ДНК мутагенны, например, 8-гидроксигуанин может вступить в комплементарное взаимодействие с аденином вместо цитозина, что часто приводит к появлению трансверсий (замен пуриновых оснований в ДНК на пиримидиновые и наоборот) GC на TA(17-19). С другой стороны, окислительное повреждение цитозина чаще приводит к транзициям (простым заменам одного пуринового или пиримидинового основания ДНК на соответствующее другое основание) GC на AT(20). В целом, транзиции GC на AT и трансверсии GC на TA являются наиболее часто встречающимися мутациями, вызываемыми окислительным стрессом (проанализировано в 21). Некоторые компоненты митохондриальной цепи переноса электронов закодированы в мтДНК.
Таким образом, четвертым допущением, лежащим в основе митохондриальной свободно-радикальной теории старения, является то, что повышенный уровень мутаций мтДНК еще больше увеличивает количество АФК, тем самым способствуя дальнейшему накоплению мутаций посредством нарушения целостности цепи переноса электронов. Этот механизм, в котором небольшое количество исходных повреждений может запустить экспоненциальный рост числа новых повреждений, создает механизм положительной обратной связи, получивший название «порочный круг» (4, 22).
2.1.1. Митохондриальная ДНК, дисфункция и этиология связанных с возрастом дегенеративных процессов: предположения и вопросы
Как сказано выше, суть митохондриальной свободнорадикальной теории старения заключается в экспоненциальном ускорении дегенерации митохондрий. В этом процессе АФК являются одновременно инициатором и ключевым медиатором движущего весь процесс механизма положительной обратной связи. Центральная роль свободных радикалов в этой модели непосредственно предполагает существование методов вмешательства, основанных на использовании антиоксидантов, нейтрализующих митохондриальные АФК, или на модуляции митохондриального синтеза АФК. Однако до того как начать обсуждение достоинств некоторых из этих методов, необходимо изучить существующие на настоящий момент экспериментальные данные (или их отсутствие), подтверждающие допущения, лежащие в основе митохондриальной свободнорадикальной теории старения.
2.1.2. Является ли митохондриальный матрикс неблагоприятной средой для ДНК?
Эксперименты на изолированных митохондриях показали, что наиболее важным источником высвобождаемых митохондрией АФК является так называемый комплекс III. Однако не существует доказательств того, что эти АФК высвобождаются во внутримембранное пространство и, соответственно, вдали от митохондриального матрикса (23). Однако другие компоненты митохондриальной цепи переноса электронов, такие как флавинмононуклеотидная группа (ФМН) комплекса I, действительно высвобождают свободные радикалы в митохондриальный матрикс в процессе нормального дыхания (24-26). Большинство данных, свидетельствующих в пользу того, что митохондрии являются основным источником свободных радикалов, получены при изучении изолированных митохондрий на различных стадиях процесса дыхания. Достоверность этих данных вызывает сомнения, в особенности из-за того, что при проведении экспериментов активность формирования АФК часто определяли в нефизиологических условиях (27). В то же время, две недавно проведенные работы показали, что в физиологических условиях супероксид и пероксид водорода продуцируются в изолированных митохондриях клеток скелетной мускулатуры и мозга соответственно (28,29). В обеих работах высвобождение АФК происходило главным образом из комплекса I. Аналогично, Kozlov et al. (30) определили повышенную продукцию АФК в митохондриях сердечной мышцы, выделенных из клеток стареющих животных, по сравнению с митохондриями клеток молодых животных группы контроля. Однако авторы этой работы пришли к выводу, что наиболее вероятным источником АФК является комплекс III, что, согласно вышесказанному, не является непосредственной угрозой биомолекулам митохондриального матрикса, таким как мтДНК.
В то время как сам по себе супероксид-радикал недостаточно активен для того, чтобы повредить ДНК (14), он может способствовать ее повреждению посредством взаимодействия со свободным железом и пероксидом водорода (Н2О2) с формированием более реактивного гидроксильного радикала, либо посредством стимуляции высвобождения железа из железо-сернистых группировок, например, входящих в состав аконитазы (15,31,32). Поэтому расположенная в митохондриальном матриксе мтДНК является потенциальной мишенью окислительного действия эндогенных АФК, генерируемых комплексом I. Активность комплекса I, в свою очередь, наиболее предрасположена к влиянию мутаций мтДНК, так как 7 из 13 кодируемых мтДНК полипептидов входят в состав этого комплекса (33). Несмотря на обширные знания, касающиеся ассоциированной с митохондриями продукции АФК in vitro, а также на доказательства их важности in vivo (это обсуждается в главе 2.1.6.), до сих пор неясно, какое реальное количество супероксидных и гидроксильных радикалов формируется в митохондриях in vivo . Разработки в области аналитических методов, такие как спектроскопия электронного парамагнитного резонанса, могут помочь в поиске ответа на этот вопрос (34).
Несмотря на существование доказательств повышения уровня железа, например, в стареющем мозге или при ассоциированных со старением заболеваниях (35), наши знания о гомеостазе железа в митохондриях и его возможном накоплении до сих пор находятся в зачаточном состоянии. В основе интересной новой гипотезы, касающейся важности нарушения гомеостаза железа при клеточном стрессе, лежит идентификация роли ферригидрита как основной формы депонированного железа в митохондриях клеток пациентов с наследственной атаксией Фридрейха. Несмотря на тот факт, что пациенты с этим диагнозом обычно не страдают от общего избытка железа, и учитывая сравнительно низкую реактивность ферригидрита, авторы одной из работ заявляют о присутствии в митохондриях потенциально токсичного двухвалентного железа, способного вызывать умеренный, но хронический окислительный стресс (36).
2.1.3. Обладают ли митохондрии способностью восстанавливать повреждения ДНК и депротеинизирована ли мтДНК?
Гипотеза, согласно которой митохондрии не способны восстанавливать повреждения ДНК, родилась на основе наблюдения, что вызываемые ультрафиолетовым излучением повреждения мтДНК не подвергаются эффективному восстановлению. Это указывает на то, что в мтДНК не происходит восстановления эксцизии (выпадения) нуклеотидов (ВЭН) (37,38). Однако, в отличие от ВЭН, присутствие в митохондриях механизмов восстановления эксцизии нуклеотидных оснований (ВЭНО) доказано (37,39,40). В частности, в митохондриях клеток крысиной печени обнаружен фермент OGG1, ответственный за ВЭНО 8OHdG(41). Более того, митохондриальная система репарации повреждений ДНК восстанавливает 8OHdG и разрывы цепочек мтДНК по крайней мере так же эффективно, как эквивалентная система ядра (39,42). Таким образом, очевидно, что в противоположность часто повторяемому исходному предположению, митохондрии способны к быстрому и эффективному восстановлению окислительных повреждений ДНК, в особенности 8OHdG.
Существуют также свидетельства того, что мтДНК не настолько депротеинизирована, как считалось ранее. Например, уже давно известно, что мтДНК не способна свободно перемещаться в митохондриальном матриксе, а связана с белками и заякорена на внутренней мембране (43). Более того, есть данные, согласно которым мтДНК может быть связана с несколькими молекулами митохондриального фактора транскрипции А, и было высказано предположение, что в митохондриях этот фактор играет роль гистоноподобного белка (описано в (44)). В соответствии с этой идеей, результаты футпринтинга (метод определения участков нуклеиновых кислот, образующих комплексы с белками) свидетельствуют о том, что мтДНК не полностью депротеинизирована, а связана с защитными белками (45).
2.1.4. Часто ли происходят окислительные повреждения мтДНК in vivo?
Митохондриальная свободно-радикальная теория старения испытала значительный подъем в 1988 году, когда Richter et al. предположили, что содержание 8OhdG в мтДНК в 16 раз выше, чем в яДНК (13). Однако с тех пор специалисты пришли к выводу, что точная количественная оценка окислительных повреждений ДНК крайне затруднительна. К возможным проблемам относятся непреднамеренное окисление ДНК в процессе выделения и подготовки образца, а также систематические расхождения между используемыми методиками (46-48). Масштаб проблемы, в особенности по отношению к более ранним методам, проиллюстрирован в исследовании, проведенном Европейским комитетом по стандартам окислительного повреждения ДНК - European Standards Committee on Oxidative DNA damage, ESCODD (49,50). В рамках этого исследования стандартизованные образцы тканей распределили между 28 лабораториями-участниками, специализирующимися на количественном анализе окислительных повреждений ДНК. Несмотря на все усилия, потраченные на стандартизацию методов и минимизацию артефактов, полученные уровни 8OhdG находились в диапазоне, крайние значения которого отличались более чем на два порядка (49,50). В 1999 году Beckman и Ames проработали литературные данные по базовым уровням 8OhdG в яДНК и мтДНК и обнаружили, что границы полученного диапазона отличаются более чем на 4 порядка (48), что свидетельствует о значительном влиянии артефактов на некоторые опубликованные данные.
Эти проблемы в большей степени относятся к мтДНК, т.к. ее количество обычно очень мало и ex vivo она больше, чем яДНК, подвержена воздействию артефактов (48,51,52). Учитывая эти сложности, не удивительно, что реальные данные о масштабе окислительных модификаций мтДНК in vivo , как в абсолютных, так и в относительных значениях, противоречивы.
Так, некоторые авторы выявляют более высокие уровни окислительного повреждения мтДНК по сравнению с яДНК (13, 53-55), в то время как другие не наблюдают подобных отличий (46,48,56). Учитывая известные артефакты, а также то, что различия между результатами, полученными разными методами и разных лабораториях, во много раз больше предполагаемых различий между мтДНК и яДНК, можно сделать вывод, что существующей на сегодняшний день информации недостаточно для доказательства того, что уровень окислительного повреждения мтДНК выше, чем аналогичный показатель для яДНК. Аналогичная ситуация наблюдается с результатами попыток доказательства того, что уровень окислительного повреждения мтДНК повышается с возрастом. При этом одни авторы отмечают ассоциированный с возрастом рост уровня повреждений (55,57-60), а другие такого роста не выявляют (61,62).
С другой стороны, недавно получено косвенное доказательство участия опосредуемого АФК повреждения ДНК в зависимом от возраста мутагенезе. С помощью высокочувствительного набора для выявления мутаций (63) Vermulst et al. продемонстрировали, что накопление точечных мутаций в мтДНК клеток мозга и сердца мышей дикого типа с возрастом экспоненциально изменяется (64). Это соответствует более ранним данным, касающимся делеций мтДНК, согласно которым груз мутаций мтДНК с возрастом увеличивается согласно экспоненциальной зависимости (65). Экспоненциальную кинетику можно интерпретировать как механизм положительной обратной связи, где частота мутаций в каждый конкретный момент времени является своего рода функцией груза мутаций, накопленного к этому моменту времени. Более того, мутации, выявленные Vermulst et al. у мышей дикого типа, на 80% оказались транзициями GC на AT, в то время как бОльшая часть оставшихся 20% мутаций - трансверсиями GC на TA(64). Этот спектр мутаций соответствует последствиям, наблюдаемым при окислительном повреждении ДНК, и, таким образом, указывает на причинную роль опосредованного АФК повреждения мтДНК (21,66). Однако это не доказывает того, что задействованный механизм опосредован свободными радикалами. В противоположность этим наблюдениям, сделанным в экспериментах на мышах, недавно замечено, что спектр мутаций, наблюдаемых в мутационных «горячих точках» человеческой мтДНК, в большей степени соответствует ошибкам работы полимеразы (67).
В целом при ближайшем рассмотрении очевидно, что большинство исходных факторов, свидетельствующих в пользу предположения, что мтДНК более подвержена окислительному повреждению, требуют, по крайней мере, детальной оценки.
2.1.5. Существуют ли доказательства «порочного круга»?
Достоверность гипотезы «порочного круга» подтверждают эксперименты на культурах нейронов, где нарушение цепи переноса электронов с помощью РНК-интерференции (РНКи) может приводить к значительному усилению окислительного повреждения ДНК и продукции АФК (68). Аналогично, временное химическое ингибирование ротеноном комплекса I in vivo ведет к необратимым повреждениям митохондрий мозга крысы, ассоциированными с усилением продукции АФК (69). Даже несмотря на то, что абсолютные уровни точечных мутаций мтДНК, выявленные Vermulst et al. (64), очень низки (<0,2 на молекулу мтДНК), наблюдаемая экспоненциальная кинетика соответствует гипотезе порочного круга.
Для непосредственного изучения функциональных последствий накопления точечных мутаций мтДНК in vivo , в том числе влияния на продукцию АФК и окислительный стресс, ученые создали целый ряд нокаутированных мышиных моделей, имеющих подверженную ошибкам мтДНК-полимеразу (70-72). У первой из таких трансгенных мышиных моделей, избирательно экспрессирующей неспособную к исправлению ошибок мтДНК-полимеразу в клетках сердца, аккумуляция как точечных мутаций, так и делеций в этих клетках происходила быстрее, чем у мышей дикого типа (72). Как следствие усиленной гибели кардиомиоцитов у трансгенных мышей развивалась кардиомиопатия, однако при этом в клетках сердечной мышцы животных не наблюдалось повышения уровня карбонилов белков, являющегося мерой оценки окислительного повреждения белков (73,74), а также снижения активности аконитазы и уровня глутатиона (75,76). При осуществлении строго качественного анализа на основе саузерн-блоттинга, проводимого после обработки мтДНК формамидопиримидин-ДНК-гликозилазой, Mott et al. не выявили зависящего от возраста роста груза окислительных повреждений мтДНК в клетках сердца трансгенных мышей (75).
Две различных модели мышей-мутаторов (для которых характерна повышенная частота возникновения соматических точечных мутаций мтДНК), несущих гомозиготные мутации мтДНК и экспрессирующих неспособную к исправлению ошибок мтДНК-полимеразу во всем организме, продемонстрировали значительное повышение груза мутаций мтДНК и целый ряд патологий, обычно ассоциированных со старением, а также значительно сниженную продолжительно жизни (70,71). Kujoth et al. (70) сравнили содержание 8OHdGв ДНК и РНК клеток печени и F2-изопростанов - широко используемого биомаркера окислительного повреждения липидов (77,78) - в тканях (скелетной мускулатуре, печени) мышей-мутаторов и мышей дикого типа и не обнаружили доказательств тотального повышения уровня окислительных повреждений. В рамках этой же работы не было выявлено значительных отличий содержания в митохондриях сердца и печени карбонилов белков, а также продукции Н2О2 изолированными митохондриями печени у мышей-мутаторов и мышей дикого типа (70).
Кроме незначительного повышения уровня карбонилов белков и не очень весомых доказательств активации экспрессии глутатионпероксидазы, Trifunovic et al. также не выявили признаков повышенного окислительного стресса в тканях второй модели мышей-мутаторов (79). Однако интересным фактом является то, что они выявили сравнимые уровни продукции свободных радикалов в мышиных эмбриональных фибробластах, выделенных из эмбрионов трансгенных мышей и мышей дикого типа, несмотря на то, что клетки первой клеточной линии практически не способны к дыханию (79). Авторы отметили, что такие результаты указывают на то, что количество АФК, продуцируемое клетками мышей-мутаторов на одну поглощенную молекулу кислорода, в реальности было бы значительно выше по сравнению с этим показателем для контрольных клеток (44). Однако, учитывая известные сложности и артефакты, связанные с оценкой продукции АФК в культурах клеток (80 и будет обсуждаться ниже), возможно также, что этот результат главным образом отражает методологические сложности, характерные для определения уровня АФК посредством in vitro методов.
В целом ни одна из мышиных моделей увеличенного количества мутаций мтДНК не обеспечивает доказательств повышенного окислительного стресса. Вместо этого такие животные демонстрируют признаки усиленной клеточной гибели (70,79). Практически не существует доказательств того, что увеличенный груз точечных мутаций мтДНК действительно ведет к общему усилению окислительного стресса, даже несмотря на то, что значительно увеличенный груз мутаций ведет к тяжелой патологии, ассоциированной с активацией механизмов клеточной гибели.
С другой стороны, мыши-мутаторы демонстрируют, что высокий уровень мутаций мтДНК ассоциирован со старением или, по крайней мере, с фенотипами, соответствующими некоторым аспектам старения. Имеет ли это отношение к нормальному старению? Закономерно возникает вопрос: как многочисленны мутации мтДНК in vivo при нормальном старении? Ассоциированное с возрастом накопление мутаций мтДНК активно изучалось как в тканях животных, так и в тканях людей. Количество специфичных точечных мутаций мтДНК, появляющихся в некодирующих управляющих регионах мтДНК, существенно возрастает по мере старения. В некоторых случаях более чем 50% всей молекулы ДНК может состоять из таких мутаций (81,82). Такие мутации, имеющие высокую тканеспецифичность (например, специфичные точечные мутации обычно возникают в клетках мышц, но не регистрируются в фибробластах и наоборот), не снижают производительность митохондриальной системы окислительного фосфорилирования, а некоторые из них могут даже обеспечивать положительную функциональную адаптацию (83).
Напротив, данные, полученные при изучении мышей дикого типа в рамках исследования с использованием мышей-мутаторов (описано выше), свидетельствуют о том, что количество точечных мутаций мтДНК, влияющих на кодирующие регионы молекул и потенциально ведущих к нарушению нормального функционирования цепи переноса электронов, сохраняется на исключительно низком уровне даже в очень старых организмах (64). Для сравнения, мыши с гетерозиготной мутацией, используемые в одной из работ, переносили 500-кратное увеличение груза точечных мутаций мтДНК без проявления каких-либо признаков патологии или преждевременного физиологического старения (рис. 1) (64). Последний результат интерпретирован как доказательство того, что сами по себе точечные мутации не аккумулируются в процессе нормального старения в количествах, настолько значительных, чтобы ограничивать продолжительность жизни (64).
Рис. 1. (А) Мутационный груз в мтДНК ткани мозга мышей дикого типа (ДТ) по сравнению с гетерозиготными (Polg /mut) и гомозиготными (Polgmut/mut) мутантным мышами. В то время как ассоциированное с возрастом увеличение количества точечных мутаций мтДНК мышей ДТ очевидно, у гетерозиготных мутантных мышей наблюдается значительное увеличение количества точечных мутаций, достигающее в 10 раз более высоких значений по сравнению с мышами ДТ, без видимых признаков преждевременного старения и митохондриальных патологий. (В) Сниженный мутационный груз в мтДНК клеток сердца мышей линии MCAT, отличающихся гиперэкспрессией каталазы в митохондриях по сравнению с мышами ДТ соответствующего возраста. Все данные заимствованы из (64).
Однако остается целый ряд открытых вопросов, которые необходимо рассмотреть, прежде чем с полной уверенностью принять этот вывод. Во-первых, у мышей-мутаторов мутации происходят на ранних этапах жизни из-за ошибок в работе полимеразы и практически не существует данных о дальнейшем ассоциированном с возрастом накоплении мутаций. У мышей дикого типа, напротив, на ранних этапах жизни мутации мтДНК происходят редко, однако по мере старения организма накапливаются согласно экспоненциальной зависимости (64). В основе этого лежат значительные отличия механизмов и динамик накопления мутаций мтДНК у мышей дикого типа и мышей-мутаторов. Возможные причинные механизмы этого будут обсуждаться далее.
Во-вторых, замечено, что некоторые фенотипы, наблюдаемые у мышей-мутаторов, указывают на бОльшую вовлеченность тканей, обладающих высокой митотической активностью (селезенка, семенники, эпидермис), чем постмитотических тканей, что характерно для настоящего преждевременного старения (84). На настоящем этапе остается непонятным, являются ли мыши-мутаторы адекватной моделью для изучения функциональных эффектов нормальной ассоциированной с возрастом утраты целостности мтДНК (84-86).
Использование методик полимеразной цепной реакции (ПЦР) также позволило выявить делеции мтДНК в различных тканях разных организмов (87-92). Считается, что большое количество наследуемых делеций мтДНК лежит в основе ряда редких заболеваний, в том числе миопатий и энцефаломиопатий (93). Более того, уровень делеций мтДНК в клетках сердца значительно увеличивается с возрастом (92), то же самое наблюдается в мозге (87,94,95). Высказано предположение, что для мтДНК клеток сердца существует корреляция между количеством делеций и количеством 8OHdG. Это указывает на то, что окислительные повреждения мтДНК могут инициировать формирование делеций мтДНК de novo (96). Возможным механизмом этого является окислительное повреждение ДНК-полимеразы, так как само по себе опосредованное АФК повреждение ДНК обычно не приводит к формированию делеций (97). Однако, как и в случае точечных мутаций мтДНК, встречаемость делеций в массе ткани очень низка и обычно, даже у очень старых животных, сохраняется на уровне, значительно более низком, чем 1% от общего количества мтДНК (88,95,98). Соответственно, с учетом сравнительно низких уровней точечных мутаций и делеций в тканях, в большинстве работ по изучению общей способности к окислительному фосфорилированию и ферментативной активности в клетках и тканях приматов и грызунов выявлена определенная степень ассоциированного с возрастом функционального спада, однако этот спад тканеспецифичен, в большинстве случаев сравнительно мал и обладает высокой степенью индивидуальной изменчивости (99-105).
В целом многие первоначальные допущения, ведущие к предположению, что мтДНК подвержена сильному окислительному повреждению, требуют уточнения и на сегодняшний день не существует убедительного доказательства того, что окислительное повреждение мтДНК действительно очень выражено in vivo . Неясно, какое функциональное значение in vivo имеет повреждение мтДНК в масштабе одно 8OHdG повреждение на 105 нуклеотидных оснований. Согласно существующим данным, окислительное повреждение мтДНК может быть причинным фактором появления точечных мутаций мтДНК и может быть также вовлечено в формирование делеций мтДНК de novo . Согласно с выводом, что в состоянии равновесия окислительное повреждение мтДНК сохраняется на низком уровне, количество делеций и точечных мутаций в кодирующих регионах мтДНК в большинстве сОлидных тканей невелико, даже у очень старых животных. В то время как нефизиологично высокие уровни мутаций мтДНК очевидно патогенны, их редкая встречаемость у нормальных животных поднимает вопрос об их функциональной значимости в контексте нормального старения.
2.1.6. Имеют ли значение митохондрии?
Означает ли все это, что митохондриальная продукция АФК и целостность мтДНК не имеют значения для старения организма? Совсем необязательно, так как существуют весомые доказательства того, что митохондриальные АФК являются важным определяющим параметром скорости старения организма. Большое количество литературных данных демонстрирует, что уровни митохондриальной продукции супероксида коррелируют со скоростью старения различных видов (106-115). Согласно недавно полученным данным, это заключение сохраняет свою правомерность даже при учете таких мешающих анализу факторов, как размер тела и филогенез (116,117). Этим наблюдениям соответствуют данные, согласно которым груз окислительного повреждения (оцениваемый по количеству 8OHdG) мтДНК, но не яДНК, обратно пропорционально коррелирует с продолжительностью жизни (118,119); однако в этом случае снова возникает вопрос о точности методологии. Прямое доказательство значимости митохондриальной продукции АФК для процесса старения млекопитающих предоставили животные модели - генетически модифицированные мыши, экспрессирующие человеческую каталазу, избирательно действующую в пероксисомах, ядрах или митохондриях. Только экспрессия каталазы, направленно действующей на митохондрии (MCAT-мыши), приводила к снижению уровня окислительного повреждения и вызывала очень существенное увеличение как средней, так и максимальной продолжительности жизни (до 21%) (120). В соответствии с причинной ролью АФК в формировании de novo точечных мутаций in vivo , в клетках сердца мышей линии MCAT накапливалось на 50% меньше точечных мутаций мтДНК, чем в клетках животных дикого типа соответствующего возраста (рис. 1) (64). В противоположность доказательству допущения, полученного в экспериментах на мышах линии MCAT, гетерозиготные нокаутированные мыши MnSOD /- не демонстрировали фенотипов, соответствующих преждевременному старению, несмотря на повышенные уровни 8OHdG как в яДНК, так и в мтДНК (121). У этих животных, однако, наблюдалась повышенная частота развития злокачественных заболеваний и на сегодняшний день неясно, наблюдается ли у них повышенное количество мутаций мтДНК. Для разрешения этих противоречий необходимо проведение дальнейших исследований митохондриальной продукции АФК, детоксификации АФК и окислительно-восстановительных механизмов, механизмов восстановления повреждений мтДНК и их влияния на ассоциированную с возрастом целостность мтДНК.
Более коррелятивное доказательство основано на наблюдении, согласно которому в организме животных, находящихся в условиях ограничения калорийности рациона, синтезируется значительно меньшее количество митохондриального супероксида и накапливается меньше делеций мтДНК. Кроме того, у таких животных реже развиваются дегенеративные заболевания, а их средняя и максимальная продолжительность жизни выше, чем у животных, питающихся ad libitum («в свое удовольствие») (122,123). Однако сам по себе супероксид не повреждает ДНК (14), а ассоциированные с ограничением калорийности рациона увеличение продолжительности жизни и предотвращение связанных с возрастом заболеваний, кроме снижения продукции супероксида и окислительного повреждения (124), могут вовлекать большое количество гормональных, физиологических и биохимических изменений - например, возможно, изменений метаболизма железа (15). Точная последовательность событий и роль АФК в этих процессах в причинно-следственном контексте до сих пор неясна.
2.1.7. Мозаичность - ключевой аспект патологии, ассоциированной с возрастным накоплением мутаций мтДНК
Важные детали, касающиеся возможной функциональной роли низких уровней мутаций мтДНК в процессе старения, открылись при изучении отдельных клеток ряда постмитотических тканей, в особенности скелетной мускулатуры. Саркопения (возрастная атрофия и утрата мышечных волокон) у человека к 80 годам приводит к потере до 40% мышечной массы (125,126). Иммуногистохимический анализ стареющей мышечной ткани выявил явное ассоциированное с возрастом увеличение количества волокон, демонстрирующих аномалии в митохондриальной цепи переноса электронов. К ним относят так называемые COX--волокна, дающие отрицательную реакцию при окраске комплекса IV (цитохром-С-оксидаза, COX) (127-129). Гибридизация in situ демонстрирует, что эти аномалии цепи переноса электронов ассоциированы с делециями мтДНК (130-132). Даже несмотря на то, что в ткани в целом общее количество делеций сохраняется на низком уровне (88), анализ пучков мышечных волокон выявил очаги, содержащие большое количество делеций в сегментах волокон, характеризующихся аномалиями цепи переноса электронов и атрофией (133-135).
С помощью лазерной микродиссекции и количественной ПЦР последовательных продольных срезов мышечных волокон можно наблюдать за прогрессией болезни вдоль индивидуальных мышечных волокон и разобраться в последовательности событий, в конечном итоге ведущих к гибели клеток и утрате мышечных волокон. Согласно результатам такого анализа, количество делеций мтДНК клонально увеличивается в пределах индивидуальных мышечных волокон, что сначала ведет к усугублению аномалий цепи переноса электронов, после чего мышечные волокна расщепляются, атрофируются и отмирают (135,136). На основе сделанных наблюдений исследователи подсчитали, что около 15% волокон мышц стареющих крыс имеют регионы со значительными нарушениями функционирования цепи переноса электронов (135).
Показано также, что клональное увеличение количества точечных мутаций мтДНК, повреждающих гены тРНК, имеет выраженную корреляцию с дефицитом COX в мышечных волокнах человека (137). В случае скелетной мускулатуры высокая степень мозаичности и клонального увеличения мутаций мтДНК обеспечивают механизм, посредством которого сравнительно низкие уровни мутаций мтДНК в массе ткани могут быть причиной возрастного ухудшения функционального и структурного состояния, обычно наблюдаемого в отдельных регионах этой ткани. Тот факт, что наиболее подверженные этому процессу волокна в конечном итоге отмирают, объясняет сохранение уровня делеций мтДНК в общей массе ткани ниже определенного уровня. Мутантные мтДНК, отрицательно влияющие на цепь переноса электронов, просто элиминируются из ткани по мере отмирания поврежденных клеток.
Очаговое распространение мутаций мтДНК встречается и в других постмитотических тканях. Согласно результатам двух независимых работ по изучению индивидуальных человеческих кардиомиоцитов, 15% и 25%, соответственно, клеток наиболее пожилых пациентов содержали делеции мтДНК (138,139). Эти же исследования выявили отсутствие делеций мтДНК в кардиомиоцитах молодых индивидуумов.
Считается, что в мозге нейроны черной субстанции подвержены повышенным уровням окислительного повреждения и накапливают в десятки раз больше делеций, чем нейроны других регионов мозга (87,98,140). Возможно, высокая окислительная нагрузка в черной субстанции является последствием высокозатратного энергетического обмена в допаминовых нейронах (141). У пожилых индивидуумов до 30% нейронов черной субстанции демонстрируют дефекты митохондриальной дыхательной активности. Для таких клеток характерны высокие уровни клонально увеличенного количества делеций (87,142,143). Кроме большой потребности в кислороде, разрушение системы «нейромеланин-железо» чревато дальнейшим усилением уровней окислительного стресса. АФК могут вызывать как высвобождение растворимого производного меланина (так называемой «melanin-free acid») и железа из меланинового каркаса. Вдобавок к присутствию допамина, комплексы железа и растворимого производного меланина делают допаминэргические нейроны черной субстанции особенно восприимчивыми к развитию окислительного стресса (144). Интересной, но не доказанной на сегодняшний день гипотезой является предположение, что in vivo этот патологический механизм включает повышенную мобилизацию железа в митохондрии. Нейротрансмиттер L-допа (L-dopa) считается золотым стандартом лечения болезни Паркинсона (БП) (145). В то же время, есть мнение, что L-допа проявляет нейротоксичное действие. Это предположение подтверждают данные Alam et al. , демонстрирующие увеличение у пациентов с болезнью Паркинсона окислительного повреждения белков в черной субстанции и регионах мозга, обычно не измененных при болезни Паркинсона (146). Это повышение уровня окислительного повреждения может быть частично обусловлено формированием цитотоксичных аддуктов (продуктов присоединения) L-допа-цистеинил, уровень которых повышается в черной субстанции пациентов с болезнью Паркинсона (147). С другой стороны, результаты исследования ELLDOPA, в рамках которого впервые проанализировали эффект доза-реакция, вызываемый L-допа у пациентов с болезнью Паркинсона, свидетельствуют в пользу нейропротективного характера действия L-допа (148).
В целом груз накопления спорадических точечных мутаций мтДНК в мозге значительно увеличивается с возрастом и отрицательно коррелирует с активностью митохондриального фермента цитохром-С-оксидазы (149,150). В толстом кишечнике также доказана роль клонально увеличенной массы точечных мутаций как причины появления крипт с дефицитом цитохром-С-оксидазы (151,152).
Во всех упомянутых выше случаях мутантные мтДНК, возможно, но не обязательно, являющиеся результатом опосредованного повреждения мтДНК активными формами кислорода, претерпевает клональную экспансию до тех пор, пока вся клетка не начинает испытывать дефицит нормального функционирования цепи переноса электронов, в то время как в ткани количество делеций мтДНК в целом сохраняется на низком уровне.
Специалисты предлагали различные модели клональной экспансии, однако точные механизмы, запускающие этот процесс, на сегодняшний момент изучены плохо (153-157). Интересно, что доказана способность ограничения калорийности рациона снижать продукцию АФК в митохондриальном комплексе I и формирование делеций мтДНК de novo . С другой стороны, существуют данные, согласно которым ограничение калорийности рациона не подавляет клональную экспансию существующих делеций мтДНК (122,123). Возможно, независящая от АФК клональная экспансия является механизмом (возможно, основным), посредством которого низкие уровни мутаций мтДНК в определенных очагах накапливаются до значений, достаточных для нарушения функционирования клеток и, в конечном итоге, тканей.
2.2. Каким образом мутации мтДНК могут послужить причинным фактором ассоциированных с возрастом нарушений функционирования тканей?
В последнее время специалисты все больше склоняются к тому, что АФК не только являются вредными побочным продуктами метаболизма, но и играют важную роль в передаче сигналов, в особенности между митохондриям и ядром, а также в управлении механизмами клеточной гибели и пролиферации (проанализировано в (7,15,158)). На сегодняшний день не существует объяснения тому, каким образом АФК избегают встречи с митохондриальными и цитозольными антоксидантными механизмами защиты и модулируют экспрессию генов в ядре.
Клетки, страдающие от клонально «размножившихся» мутаций мтДНК, влияющих на цепь переноса электронов, часто испытывают снижение эффективности переноса электронов. Такие изменения могут повышать концентрацию кислорода внутри митохондрий из-за уменьшения потребления кислорода, а также способствовать дальнейшему снижению эффективности цепи переноса электронов. Это должно повышать продукцию АФК, что, в комплексе с низкими уровнями АТФ, может стимулировать механизмы клеточной гибели (159,160).
Следовательно, как и в случае саркопении, мутации мтДНК могут стимулировать ассоциированные с возрастом нарушения функций постмитотических тканей посредством запуска гибели клеток, не способных к восстановлению (161,162). Повышенная восприимчивость клеток и организмов к стрессорным стимулам и воздействиям является одной из определяющих характеристик процесса старения у всех подверженных ему видов.
Эту модель подтверждают результаты экспериментов in vitro с использованием клеток, несущих унаследованную патологию мтДНК (163), а также данные, полученные на трансгенных мышиных моделях, таких как мыши-мутаторы, которые часто (но не всегда) демонстрируют повышенный уровень клеточной гибели как фенотип, характерный для генетических вмешательств, отрицательно сказывающихся на целостности мтДНК (проанализировано в (162)).
Известно, что опосредуемые АФК и окислительно-восстановительными реакциями сигнальные механизмы влияют на различные процессы, в том числе на гомеостаз энергии, устойчивость к стрессу, воспаление, митогенез и порог клеточной гибели (7,15,158). Постепенная утрата целостности мтДНК, ассоциированная с изменениями гомеостаза энергии и окислительно-восстановительным статусом, потенциально может оказывать влияние на широкий спектр клеточных процессов, результатом чего может быть нарушение тканевого гомеостаза посредством запуска дополнительных механизмов, таких как провоспалительные реакции.
Обсуждается также существование альтернативных механизмов, в силу которых низкие уровни очагово-распространенных мутантных мтДНК могут быть причиной значительных нарушений функционирования тканей (133,164-167). Некоторые из этих гипотез подразумевают механизмы, посредством которых клетки, содержащие мутации мтДНК, могут оказывать выраженное токсическое влияние на окружающую ткань (165,166). Одна из таких теорий, получившая название «гипотеза восстановительной горячей точки» ("reductive hotspot hypothesis"), основана на предположении, что клетки могут компенсировать присутствие митохондрий с нарушениями в цепи переноса электронов посредством снижения уровня молекулярного кислорода с помощью окислительно-восстановительной системы плазматической мембраны, продуцируя внеклеточный супероксид и повышая окислительную нагрузку на окружающую ткань (165,167). Альтернативная гипотеза, предложенная Mott et al. в 2005 году (164), гласит, что митохондриальные мутации ведут к транскрипции закодированных в мтДНК белков с аномальной структурой молекул, которые впоследствии взаимодействуют с митохондриальными медиаторами клеточной гибели. Согласно этой гипотезе, из-за хрупкости баланса между медиаторами, опосредующими запуск или предотвращение клеточной гибели, даже небольшое количество аберрантных транскриптов потенциально способно вызывать гибель клетки (164).
3. Аргументы в пользу направленных определяющих факторов базальной скорости старения, а не индивидуальных ассоциированных с возрастом заболеваний
В настоящее время стареющие популяции промышленно развитых стран живут в условиях низкой смертности по внешним причинам. Ведущими причинами заболеваемости и смертности в этих странах являются хронические дегенеративные заболевания. Закономерно, что огромное количество ресурсов тратится на поиски лечения или эффективных профилактических мер для каждого из этих заболеваний (168). Однако, поскольку возраст сам по себе не является единственным наиболее важным фактором риска для большинства дегенеративных заболеваний, лечение или профилактика любого из них в стареющей популяции с большой вероятностью приведет к его быстрой замене другим, возможно, не менее тяжелым заболеванием. Таким образом, по мере старения популяции, вмешательства, направленные на лечение или предотвращение определенных заболеваний, будут все больше и больше снижать общую смертность, а также ассоциированные затраты на обеспечение работы систем медицинского обслуживания.
Для сравнения, увеличение продолжительности жизни на 20%, наблюдаемое у генетически модифицированных MCAT-мышей, экспрессирующих человеческую каталазу (см. раздел 2.1.6.), имело бы в 5 раз больший эффект, чем результат, прогнозируемый на тот случай, если удастся устранить из человеческой популяции все формы рака (169,170). Интересен тот факт, что у MCAT-мышей отложено развитие патологий сердца и формирование катаракты, что указывает на снижение выраженности ассоциированных с возрастом заболеваний, одновременно со снижением базовой скорости старения (120). Преобладание скорости старения над прогрессированием специфических патологических процессов было впоследствии изящно продемонстрировано в 2004 году путем сравнения времени начала и скорости прогресса нейродегенерации, обусловленной спектром функционально эквивалентных мутаций ортологичных генов пяти видов млекопитающих с максимальной продолжительностью жизни от 3,5 лет (мыши) до 122 лет (человек) (161). Согласно анализу полученных данных, скорость нейродегенерации в каждом случае пропорционально уменьшается с увеличением максимальной продолжительности жизни, несмотря на то, что в основе двух процессов лежат идентичные молекулярные механизмы. В ответ на функционально идентичные мутации быстрее стареющие виды прогрессируют в соответствии с идентичными последовательностями нейродегенеративных событий со скоростью, пропорционально более высокой, чем скорость, характерная для медленнее стареющих видов (161). Утрата клеток посредством активации механизмов клеточной гибели является критическим моментом во всех рассматриваемых заболеваниях.
Как описано выше, митохондрии и митохондриальная продукция АФК сложным образом взаимосвязаны с порогом запуска и осуществлением механизмов клеточной гибели, и митохондриальное модулирование этих механизмов, таким образом, может быть важным фактором, объясняющим вышеописанный феномен (161). Возможность того, что митохондриальная продукция АФК и целостность мтДНК, возможно, являются важными определяющими факторами гибели клеток и зависящих от возраста воспалительных процессов, а также базальной скорости старения организма, делает митохондрии основной мишенью для разработки методов терапии, направленной на предотвращение или смягчение ассоциированных с возрастом дегенеративных процессов. Когда будут доступны методы точного модулирования целостности мтДНК in vivo , тестирование влияния снижения груза мутаций мтДНК на продолжительность жизни предоставит больше ответов на вопрос о том, имеет ли повреждение мтДНК отношение к старению.
4. Стратегии
Существуют доказательства того, что по мере старения организма во многих тканях происходит накопление умеренного количества окислительных повреждений белков, липидов и ДНК (171-176), в то время как увеличение их общего количества достаточно невелико. Кроме того, часть выявляемых повреждений демонстрирует свойства, несоответствующие повреждениям, возникающим случайным стохастическим образом. Например, окислительные модификации белка наблюдаются преимущественно в небольшом количестве определенных мишеней (описано в (15)). Согласно одному из предположений, основанных на свободно-радикальной теории старения, антиоксиданты должны замедлять старение организма. Как описано выше, АФК действительно могут вызывать по крайней мере часть исходных мутаций мтДНК. Однако на сегодняшний день существует мало доказательств значительного и происходящего случайным образом увеличения количества окислительных повреждений, изначально предполагаемого теорией «порочного круга». Более того, многие связанные с возрастом заболевания сами по себе ассоциированы с усилением окислительного повреждения (15,35). Таким образом, при изучении опосредуемых АФК макромолекулярных повреждений и старения очень сложно дифференцировать причины от последствий (7). Это имеет большое значение для любой стратегии вмешательства, основанной на модулировании митохондриальной продукции АФК.
Эксперименты на MCAT-мышах и мышах, содержащихся в условиях ограничения калорийности рациона (64,122,123), предоставили ряд доказательств того, что снижение последствий опосредованных АФК повреждений в митохондриях защищает мтДНК и увеличивает продолжительность жизни. Однако, согласно обобщенным выше данным, опосредованный АФК мутагенез мтДНК de novo , скорее всего, является сравнительно редким явлением. Механизм клональной экспансии подразумевает, что стратегии, направленные на модуляцию или связывание митохондриальных АФК, предположительно могут оказывать влияние только на мутагенез de novo и не влияют на уже сформировавшиеся мутации мтДНК. Таким образом, подобные стратегии требуют длительного применения, причем их эффективность будет снижаться по мере старения организма. Модуляция механизмов восстановления повреждений мтДНК является малоизученным подходом к воздействию на целостность мтДНК и достойна большего внимания. Большинство обсуждаемых ниже традиционных стратегий направлено на модулирование продукции митохондриальных АФК и реакций окислительного фосфорилирования.
4.1. Митохондриальные нутриенты
Критическим моментом является поддержание стабильного состояния митохондрий в процессе старения. Целостность митохондрий зависит от огромного количества биомолекул, часть из которых, кроме эндогенного биосинтеза, может поступать в организм непосредственно из пищи и пищевых добавок. С учетом важности для биоэнергетики митохондрий таких соединений, как L-карнитин/ацетил-L-карнитин, коэнзим Q10 (CoQ10) и липоевая кислота, повышение их уровня в организме посредством диетических или фармацевтических вмешательств считается перспективной стратегией сохранения здоровья и замедления старения.
Перед обсуждением эффективности этих так называемых митохондриальных нутриентов в предотвращении старения и ассоциированных с возрастом заболеваний, мы предоставим краткую информацию о: 1) L-карнитине/ацетил-L-карнитине, коэнзиме Q10 (CoQ10) и липоевой кислоте; 2) возможных механизмах их действия и 3) доказательствах их потенциального положительного влияния на состояние здоровья, которые можно получить в результате испытаний на людях.
4.1.1. L-карнитин/ацетил-L-карнитин
4.1.1.1. Базовая информация
Четырехкомпонентное соединение аммония L-карнитин встречается повсеместно. В организме человека L-карнитин синтезируется из его предшественников, аминокислот лизина и метионина, почками, мозгом и, в особенности, печенью со среднесуточной скоростью в среднем 1,2 мкмоль/кг массы тела. Однако бОльшая часть L-карнитина содержится в скелетных мышцах человека. Биосинтез L-карнитина тесно взаимосвязан с внешней митохондриальной мембраной (177, 178).
L-карнитин необходим для бета-окисления длинных цепочек жирных кислот в митохондриях (рис. 2). Следовательно, в состоянии дефицита L-карнитина организм не может утилизировать основной источник энергии (жир) для синтеза АТФ (177). L-карнитин входит в состав практически всех продуктов питания. Однако по сравнению с продуктами растительного происхождения животная пища содержит гораздо больше L-карнитина, существующего как в свободной, так и в ацетилированной (связанной с жирными кислотами) форме. Ацетил-L-карнитин составляет 5-30% от всего L-карнитина пищи (177,179). Несмотря на дефицит информации о потребностях в L-карнитине на протяжении жизненного цикла, результаты некоторых работ свидетельствуют об ассоциированном с возрастом снижении уровня L-карнитина в различных тканях не только животных, но и человека (179,180).
Рис. 2. Локализация и ключевые функции митохондриальных нутриентов (подробности в тексте). (А) Коэнзим Q10 (CoQ) осуществляет перенос электронов с комплексов I и II на комплекс III. Липоевая кислота в форме липоамида выступает в качестве кофактора митохондриальных ферментов альфа-кетоглутаратдекарбоксилазы (a-KG-DC) и пируватдегидрогеназы (P-DH). Липоевая кислота также необходима для катализа круговорота альфа-кетокислот с разветвленными цепочками (не показано). (В) Карнитин способствует переносу длинноцепочечных жирных кислот через внешнюю и внутреннюю митохондриальные мембраны (ACS = ациокоэнзим-А-синтетаза; CACAT = карнитин-карнитин-ацилкарнитинтранслоказа; CAT = карнитинацетилтрансфераза; CPT = карнитин-пальмитоилтрансфераза). Диаграмма заимствована из (23,177,241).
4.1.1.2. Возможные механизмы действия
4.1.1.2.1. Влияние на биоэнергетику митохондрий
Как упомянуто ранее, снижение активности митохондриальных ферментов является признаком процесса старения. Субхроническое добавление 300 мг/кг L-карнитина в рацион стареющих крыс (>22 месяцев) предотвращало связанное с возрастом снижение активности в тканях мозга как отдельных ферментов цикла трикарбоновых кислот (цикла Кребса), так и комплексов I и IV цепи переноса электронов, поддерживая их уровни в пределах значений, сравнимых с аналогичными показателями для мозга молодых (3-4 месяца) животных. Следует отметить, что L-карнитин не вызывал никаких значительных изменений в мозге молодых животных (181). Эффекты употребления добавок L-карнитина на активность митохондриальных ферментов не ограничиваются тканями мозга и наблюдаются в других тканях, таких как скелетные мышцы и сердце (182).
Специфичное для мозга повышение активности цитохромоксидазы (комплекс IV) в синаптических и несинаптических митохондриях также наблюдалось при добавлении ацетил-L-карнитина в рацион крыс (183,184). У тех же самых животных активность ферментов цикла Кребса, в особенности цитратсинтетазы, снижалась во всех рассматриваемых регионах мозга, что указывает на различные модулирующие эффекты ацетил-L-карнитина и L-карнитина в отношении энергетического метаболизма мозга. Изменения в статусе ацетилирования остатков лизина рассматривают как один из возможных механизмов действия ацетил-L-карнитина на активность митохондриальных ферментов (185).
Более того, внутривенное введение ацетил-L-карнитина в дозе 500-750 мг/кг вызывало значительное региональное повышение скорости метаболизма глюкозы у крыс, в то время как одновременное использование ацетата и L-карнитина никак не влияло на утилизацию глюкозы (186). Как отмечено выше, ацетил-L-карнитин действует как переносчик ацильных групп, в том числе для синтеза ацетилхолина, между митохондриями и цитозолем. Поэтому интересно отметить, что ацетил-L-карнитин наиболее значимо усиливает метаболизм глюкозы в подкорковых холинэргических регионах. Аналогичное влияние ацетил-L-карнитина на запасы энергии выявлено Al-Majid et al. (187), которые отметили 50%-е увеличение уровня АТФ в гиппокампе крыс, получивших (внутрибрюшинно) ацетил-L-карнитин в дозе 300 мг/кг. Аналогичный протокол обеспечивал значительную степень защиты от индуцируемого ишемией окислительного стресса и повреждения клеток гиппокампа. Прием крысами пероральных добавок ацетил-L-карнитина в концентрации 1,5% (вес/объем) в течение одного месяца приводил к значительному восстановлению ассоциированного с возрастом снижения потребления кислорода и метаболических параметров, таких как глюконеогенез, в модели перфузированной печени. Однако считается, что положительная регуляция потребления кислорода обусловлена скорее повышением активности ацил-СоА-синтетазы, чем увеличением максимальной кислородной емкости (188). Интересен тот факт, что в одинаковых условиях проведения эксперимента одна и та же группа исследователей выявила не только усиленную респирацию скелетных мышц у старых крыс, употреблявших ацетил-L-карнитин, но и значительно повышенную массу митохондриальных белков (189). Так как ацетил-L-карнитин быстро гидролизуется до L-карнитина, очень трудно определить, являются ли наблюдаемые после внутривенного и внутрибрюшинного введения ацетил-L-карнитина эффекты результатом действия самого соединения. Данные по активности перорально принимаемого ацетил-L-карнитина также следует интерпретировать с особым вниманием, так как всасываемый в тонком кишечнике ацетил-L-карнитин начинает деацетилироваться до L-карнитина уже в интестинальных клетках, в которых L-карнитин, в свою очередь, частично реацетилируется до ацетил-L-карнитина. В целом, из-за высокой скорости метаболизма ацетил-L-карнитина, очень трудно четко разграничить эффекты, связанные с L-карнитином и ацетил-L-карнитином (190, 191).
4.1.1.2.2. Влияние на антиоксидантную защиту
Несмотря на то, что L-карнитин и его производные (а именно ацетил-L-карнитин и пропионилкарнитин) не обладают выраженной непосредственной антиоксидантной активностью (как можно предположить по химической структуре их молекул (15)), их способность косвенно модулировать систему антиоксидантной защиты периодически упоминается в литературе. Параллельно с восстановлением активности ферментов цикла Кребса и митохондриальных комплексов в определенных регионах мозга крыс, субхронически принимавших L-карнитин в дозе 300 мг/кг, наблюдалось улучшение антиоксидантного статуса мозга, о чем свидетельствовало повышенное содержание глутатиона, аскорбиновой кислоты и альфа-токоферола, а также сниженная аккумуляция липофусцина, карбонилов белков и продуктов перекисного окисления липидов (активных форм тиобарбитуровой кислоты) (192). Несмотря на широкое использование, уровень активных форм тиобарбитуровой кислоты нельзя считать количественным показателем, отражающим ущерб, наносимый окислением липидов, так как на формирование активных форм тиобарбитуровой кислоты влияет огромное количество соединений (15). Значимость изменений уровня аскорбиновой кислоты у животных, способных самостоятельно синтезировать это соединение, оценивать очень трудно.
Введение 400 мг/кг ацетил-L-карнитина мышам линии SAMP8 (склонным к быстрому физиологическому старению) три раза в неделю до достижения ими 4-месячного возраста значительно снижало уровень гидроперекиси в мозге. При этом у животных значительно улучшались показатели связанных с возрастом нарушений способности к обучению и памяти (193). Учитывая различные фенотипы линий SAMP(194), предположительно обусловленные механизмами, отличными от процесса старения как такового, модель SAMP может быть ценным средством для изучения хронических дегенеративных заболеваний.
В рамках двух работ исследователи сравнивали эффекты пропионилкарнитина и L-карнитина на антиоксидантный статус и биомаркеры окислительного стресса в сердце и аорте крыс со спонтанной гипертензией и нормальным давлением (195,196). В целом состояние гипертензивных животных улучшалось при введении пропионилкарнитина и L-карнитина. В то же время пропионилкарнитин оказывал незначительное действие на аорты здоровых животных, а L-карнитин негативно влиял на метаболизм, что проявлялось в ухудшении НАДФН-стимулированной продукции супероксида и снижении экспрессии эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS). На основании последнего наблюдения можно предположить, что полезные эффекты L-карнитина ограничены состояниями дисфункций (такими как старение и болезни) и, возможно, абсолютно бесполезны для предотвращения нормального возрастного ухудшения функций здорового организма.
С другой стороны, L-карнитин обладает способностью повышать количество других антиоксидантов, таких как альфа-токоферол, в печени крыс (197). В противоположность этому, краткосрочный прием ацетил-L-карнитина не только снижает уровень витамина С в гепатоцитах (но не в ткани сердца) как молодых, так и стареющих крыс, но и повышает формирование маркера перекисного окисления липидов малонового диальдегида, оцениваемое с помощью газовой хроматографии/масс-спектрометрии (адекватный биомаркер конечного продукта перекисного окисления липидов), в печени старых крыс (198). Однако, опять же, влияние на биосинтез аскорбиновой кислоты необходимо рассматривать с учетом интерпретации изменений ее уровня.
Несмотря на огромную заинтересованность в применении L-карнитина, ацетил-L-карнитина и пропионилкарнитина для предотвращения и/или уменьшения последствий патологий, связанных с окислительным стрессом и, соответственно, со старением, очень мало известно о реальном влиянии этих соединений на антиоксидантный статус и уровень окислительного стресса в организме человека. В соответствии с результатами упомянутых выше исследований на животных, у женщин, в течение трех недель перорально принимавших L-карнитин в дозе 680 мг/день, наблюдались повышенные уровни ретинола и альфа-токоферола в плазме. Одновременно у них было значительно снижено количество продуктов перекисного окисления липидов в плазме (199), хотя значимость последнего наблюдения неясна из-за использования метода оценки уровня активных соединений тиобарбитуровой кислоты, часто выдающего ошибочные результаты. При оценке уровня 8OHdG в мозге крыс с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической индикацией Haripriya et al. выявили значительное снижение частоты повреждений мтДНК у старых животных, получавших L-карнитин (200). Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической индикацией считается лучшим методом для количественного определения 8OHdG, хотя до сих пор сохраняется неопределенность по поводу точных фоновых уровней 8OHdG(47).
4.1.1.3. Исследования воздействия на человека в отношении старения и ассоциированных с возрастом заболеваний
L-карнитин и его производные эффективны при лечении первичных дефицитов карнитина. Общие выводы, сделанные на основе результатов этих исследований, исчерпывающе проанализированы в работах других авторов (201,202).
Так как уровень карнитина снижается по мере старения и, вероятно, может быть недостаточным для обеспечения возрастающей по мере старения потребности, специалисты уделили большое внимание возможностям использования и эффективности L-карнитина, ацетил-L-карнитина и пропионилкарнитина для подавления патологических проявлений ассоциированных с возрастом болезней (203). Пропионилкарнитин, высокоспецифичный для скелетной и сердечной мышц, использовали для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (204). В первичных маломасштабных испытаниях прием пропионилкарнитина оказывал значительное влияние на способность пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями переносить физическую нагрузку (204). Результаты последующего мультицентрового исследования подтверждают способность пропионилкарнитина повышать продолжительность физической нагрузки, переносимой пациентами с хронической сердечной недостаточностью, находящимися на стабильной фармакотерапии. Следует отметить, что лучшие результаты приема пропионилкарнитина наблюдаются у пациентов с относительно сохраненной функцией миокарда и, соответственно, с умеренным ухудшением физического состояния (205). При оценке влияния перорального приема L-карнитина (2 г в сутки, в течение 6 месяцев) на физическую и умственную усталость людей в возрасте 100 и более лет, а также на их познавательную функцию в рамках рандомизированного исследования, проводимого двойным слепым методом под контролем плацебо, Malagnarnera et al. обнаружили значительное улучшение всех трех параметров (206). Однако на основе предположения, что ацетил-L-карнитин попадает в организм человека, и наблюдения, согласно которому он перемещается через гематоэнцефалический барьер быстрее, чем L-карнитин, с помощью насыщаемого натрий-зависимого процесса, среди производных карнитина ацетил-L-карнитин является соединением выбора при изучении возможного положительного влияния ацетил-L-карнитина на когнитивную функцию пожилых людей (185,207). При этом при лечении ацетил-L-карнитином наблюдается тенденция к снижению проявлений ухудшения когнитивной функции, в особенности у пациентов с исходно менее выраженными нарушениями (185). Однако, в силу небольшого количества пациентов, участвовавших в этих исследованиях, а также скорее умеренного влияния ацетил-L-карнитина на когнитивный статус, необходимо проведение дальнейших исследований с целью оценки эффективности ацетил-L-карнитина при лечении слабоумия.
4.1.2. Коэнзим Q10
4.1.2.1. Базовая информация
Коэнзим Q(также известен как убихинон) состоит из 2,3-диметокси-5-метилбензохинонового ядра и боковой цепи, состоящей из молекул изопрена (208). Коэнзим Q10 (CoQ10) - наиболее распространенное производное убихинона, входящее в состав тканей и биологических жидкостей человека, где оно встречается в виде различных форм, дифференцируемых в зависимости от окислительно-восстановительного статуса хинонового ядра (208-210):
1. полностью окисленная форма - убихинон (Q)
2. частично восстановленная, свободнорадикальная форма - убисемихинон (•QH)
3. полностью восстановленная форма - убихинол (QH2)
Потенциальное положительное влияние CoQ10 на здоровье в основном связано с его ключевой ролью в биоэнергетике митохондрий (рис. 2) и, возможно, с его непосредственной и косвенной антиоксидантной активностью (208,211), хотя другие функции CoQ10, например, модулирование генной экспрессии, также рассматриваются (212). Поддержание функционирования митохондрий и удаление АФК рассматривают как механизмы предполагаемых профилактических и терапевтических эффектов, проявляемых CoQ10 в отношении сердечно-сосудистых, нейродегенеративных и митохондриальных заболеваний (202,209,213). Так как употребление обычных продуктов питания в норме не оказывает значительного влияния на уровень CoQ10 в плазме, для повышения его концентрации в крови необходимо добавление в рацион обогащенных CoQ10 добавок (209).
Несмотря на то, что соотношение CoQ10H2/CoQ10 подвержено доаналитическим вариациям (таким как время, прошедшее после забора крови), этот показатель предложен в качестве возможного биомаркера для оценки уровня окислительного стресса in vivo (214,215). При изучении образцов плазмы здоровых мужчин Wada et al. обнаружили небольшое, но достоверное увеличение относительного содержания окисленной формы CoQ10 у индивидуумов старшего возраста (20-39 лет - 3,1±0,9%; 40-59лет - 3,6±1,2%; >60 лет - 4,7±1,6%) (216), в то время как уровень CoQ10H2 оставался постоянным независимо от возраста. Хотя авторы последней работы пришли к выводу о существовании ассоциации между окислительно-восстановительным статусом CoQ10 и календарным возрастом, еще необходимо выяснить, являются ли эти небольшие изменения содержания CoQ10 в плазме биологически значимыми в отношении старения и начала развития хронических дегенеративных заболеваний.
4.1.2.2. Возможные механизмы действия
4.1.2.2.1. Влияние на биоэнергетику митохондрий
Перенос электронов через внутреннюю митохондриальную мембрану формирует основу митохондриальной респирации и синтеза АТФ. CoQ10 играет в этом клеточном процессе фундаментальную роль посредством переноса электронов от комплексов I и II к комплексу III(217).
Ткань сердца, в силу повышенной потребности в АТФ, особенно богата CoQ10. Дисфункции миокарда часто выявляются у пожилых людей и часто усугубляются во время вмешательств, индуцирующих аэробный или ишемический стресс (218). Ежедневное внутрибрюшинное введение старым крысам (35 месяцев) CoQ10 в течение 6 недель (4 мг/кг) значительно улучшало поглощение кислорода сердечной тканью и способствовало восстановлению работы сердца по сравнению с животными группы контроля (218). Аналогично, образцы тканей пациентов (>70 лет), получавших 300 мг CoQ10 в день (в течение 7 дней) до проведения операции на сердце, демонстрировали более эффективную митохондриальную респирацию и более быстрое восстановление после периода гипоксии по сравнению с индивидуумами группы контроля. Судя по всему, эти эффекты непосредственно связаны с повышением уровня CoQ10 в ткани и, соответственно, в митохондриях (218).
Так как нарушение работы митохондрий является признаком нейродегенерации, специалисты неоднократно тестировали эффективность лечения CoQ10 в отношении восстановления и/или поддержания митохондриальной биоэнергетики мозга. Однако адекватная интерпретация данных, подобных представленным ниже, полученным в экспериментах на употреблявших пероральные добавки CoQ10 грызунах, затруднена тем фактом, что в организме мышей и крыс CoQ9 встречается в гораздо бОльших количествах, чем CoQ10 (209). Тем не менее, результаты исследований на животных свидетельствуют о том, что добавки CoQ10 способны ослаблять распад АТФ в мозге при введении нейротоксинов, таких как малонат, 3-нитропропионовая кислота, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) или аминооксиуксусная кислота (описано в (210)). Тем не менее, очень мало известно о том, оказывает ли лечение CoQ10 непосредственное влияние на митохондрии мозга. Согласно широко распространенному мнению, употребление CoQ10 не приводит к повышению уровня эндогенного CoQ10, кроме его содержания в плазме и печени. В противоположность этому представлению, повышенные уровни CoQ10 обнаружены в ткани мозга крыс после перорального приема CoQ10 (200 мг/кг, в течение 2 месяцев) и его водорастворимой формы (150 мг/кг, в течение 4 и 13 недель) (219,220). Согласно результатам более поздней работы Sohal et al. (2006), повышение уровня CoQ10 наблюдается в гомогенатах печени, сердца, почек и скелетных мышц, а также изолированных митохондрий мышей, на протяжении длительного времени принимавших различные концентрации CoQ10 (221). Несмотря на липофильную природу CoQ10, авторы не обнаружили признаков увеличения концентрации CoQ10 в мозге. Более того, ни у одного из животных добавки CoQ10 никак не влияли на активность оксидоредуктазы митохондриальной цепи переноса электронов и состояние активной респирации («состояние 3»), оценивавшихся на 19-м и 25-м месяце жизни, и никак не изменяли продолжительность жизни (221). Эти данные соответствуют более ранним результатам, полученным в экспериментах на мышах (222,223) и плодовых мушках дрозофилах, у которых также не наблюдалось увеличения средней и максимальной продолжительности жизни (224). В действительности, кормление дрозофил CoQ10 в концентрации 1,25 мг/мл среды не только повышало продукцию АФК, но и уменьшало продолжительности жизни (225). С учетом важности прооксидантных эффектов CoQ10, оказываемых посредством синтеза супероксида и перекиси водорода, главным образом через промежуточное соединение CoQ10-семихинон, в организмах, (пере)насыщенных CoQ10, вполне закономерно ожидать усиленную продукцию АФК (226). Результаты исследований эффектов CoQ10 на червях Caenorhabditis elegans (C. elegans), являющихся общепризнанной моделью для изучения модулируемых окислительным стрессом процессов старения в постмитотических тканях, также противоречат друг другу (217,227).
4.1.2.2.2. Влияние на антиоксидантную защиту
Убихинол (CoQH2), входящий в состав биологических мембран и липопротеинов, подавляет перекисное окисление липидов путем поглощения перекисных радикалов. Более того, CoQH2 участвует в: 1) связывании активных форм азота, таких как оксид азота и пероксинитрит (228) и 2) в регенерации альфа-токоферола путем восстановления альфа-токофероксил-радикалов. Этот эффект с биологической точки зрения считается более важным, чем непосредственное связывание свободных радикалов (15). В то время как, согласно результатам нескольких экспериментов на культурах клеток, CoQ10 обладает мощным антиоксидантным действием (229), результаты исследования, проведенного на кератиноцитах роговицы кролика, свидетельствуют о том, что CoQ10 предотвращает гибель клеток, независимо от своей способности связывать свободные радикалы (230). Еще одним потенциально интересным эффектом CoQ10 обязан своему предполагаемому взаимодействию с митохондриальными разобщающими белками. Традиционно считается, что активация МРБ снижает груз продукции митохондриальных АФК (210,231).
Однако результаты работ по изучению влияния CoQ10 на антиоксидантный статус и антиоксидантную защиту у животных и, в особенности, у человека не настолько убедительны. У крыс, содержащихся на рационе, богатом полиненасыщенными жирными кислотами, и дополнительно получавших CoQ10, наблюдалось повышенное содержание и/или активность CoQ10, альфа-токоферола и каталазы в ткани сердца. Употребление добавки CoQ10 также снижало выраженность ассоциированного с возрастом ухудшения функций митохондрий и снижало уровни гидропероксида ex vivo , оцениваемые с помощью метода окисления железа с последующим окислением ксиленола оранжевого (ferrous oxidation in xylenol orange, FOX), в митохондриях сердца. Эти результаты свидетельствуют о способности CoQ10 в ряде случаев оказывать как прямые, так и косвенные антиоксидантные эффекты in vivo (232). Однако, как упомянуто выше, Sohal et al. (2006) не смогли выявить никакого положительного влияния продолжительного приема CoQ10 на биоэнергетику митохондрий (221). На самом деле, несмотря на накопление CoQ10 в тканях (кроме центральной нервной системы), такие показатели, как содержание моноксида углерода, глютатионовое окислительно-восстановительное состояние тканей и активность супреоксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы, не изменялись в печени, почках, скелетной мускулатуре, сердце и мозге (221). С другой стороны, значительная антиоксидантная защита наблюдалась в отношении липопротеинов, выделенных из тканей животных и людей, получавших добавку CoQ10 (214,233), что указывает на способность CoQ10 оказывать положительное влияние на гомеостаз, по крайней мере, одного из предполагаемых ключевых соединений, запускающих развитие атеросклероза (т.е. окисленных липопротеинов) in vivo . Говорить о том, распространяется ли этот вывод на ткани живого организма, в особенности мозга, на основании существующих данных невозможно.
4.1.2.3. Исследования воздействия на человека в отношении старения и ассоциированных с возрастом заболеваний
Доказано, что ткань миокарда и плазма пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями содержат меньше CoQ10, чем соответствующие ткани здоровых индивидуумов. С 1960-х годов влияние CoQ10 на состояние сердечно-сосудистой системы проанализировано в рамках более чем 20 работ с участием пациентов с кардиомиопатией и застойной сердечной недостаточностью. Несмотря на то, что при проведении нескольких маломасштабных исследований не выявлено положительного влияния CoQ10, недавно проведенный мета-анализ показал, что CoQ10 улучшает систолическую функцию при хронической сердечной недостаточности, в особенности при небольших поражениях сердца, возможно, благодаря большему количеству клеток, способных к восстановлению (234). Для этого, однако, недостаточно только довести уровень CoQ10 в плазме до нормальных значений, необходимо также добиться того, чтобы концентрация CoQ10 превышала нормальные показатели, предположительно для обеспечения максимального поглощения тканью (235). Опубликовано также, хотя и менее убедительное, доказательство влияния CoQ10 на состояние больных с ишемической болезнью сердца (236).
Существуют данные, полученные в экспериментах на животных, согласно которым в случае нейродегенерации CoQ10 может выступать в качестве нейропротектора (237,238). Несмотря на то, что дефицит CoQ10 доказан при нейродегенеративных заболеваниях, пероральный прием препаратов CoQ10 пациентами с болезнью Паркинсона и хореей Гентингтона вызывал лишь незначительное улучшение неврологических симптомов. Состояние пациентов с хореей Фридрейха улучшалось при приеме CoQ10 (в комбинации с витамином Е), что проявлялось в улучшении биоэнергетики скелетных и сердечной мышц, однако никакого положительного влияния на неврологические параметры при этом не наблюдалось (239). На сегодняшний день не существует данных, полученных в результате клинических испытаний, которые свидетельствовали бы в пользу использования CoQ10 для профилактики или лечения болезни Альцгеймера (240).
4.1.3. Альфа-липоевая кислота
4.1.3.1. Базовая информация
Также как L-карнитин и CoQ10, липоевая кислота является природным соединением, наиболее часто ковалентно связанным с эпсилон-аминогруппой остатка лизина. Липоевая кислота обычно встречается в продуктах растительного (шпинат) и животного (сердце) происхождения. Читается, что липоевая кислота синтезируется в митохондриях из октановой кислоты и сернистых соединений (241-243).
Окислительное декарбоксилирование пирувата, альфа-кетоглутарата и разветвленных альфа-кето-кислот происходит в митохондриях и находится в критической зависимости от липоевой кислоты (в форме липоамида), которая в данном случае выступает как ферментативный кофактор (рис. 2). Во время переноса ацильных групп от ферментативного комплекса к другой биомолекуле липоевая кислота восстанавливается до дигидролипоевой, которая в присутствии липоамиддегидрогеназы может окислиться обратно в липоевую с формированием НАДН (243).
Считается, что свободная липоевая кислота является наиболее важной терапевтической формой липоевой кислоты. В то время как употребление обычной пищи ассоциировано только с незначительными уровнями свободной липоевой кислоты, прием ее очищенной формы вызывает значительный, но кратковременный подъем концентрации свободной липоевой кислоты в плазме (243). Кроме участия в регуляции митохондриального энергетического метаболизма посредством переноса электронов к НАД , окислительно-восстановительная пара липоевая кислота/дигидролипоевая кислота в свободной, не связанной с белками, форме оказывает значительное влияние на равновесие клеточного окислительного стресса in vitro. Открытым остается вопрос, до какой степени свободная липоевая/дигидролипоевая кислота действует как антиоксидант in vivo или ее предполагаемая эффективность является результатом подержания и восстановления уровней других поглотителей АФК, таких как глутатион и витамин С (242,244).
4.1.3.2. Возможные механизмы действия
4.1.3.2.1. Влияние на биоэнергетику митохондрий
Влияние внутривенного введения липоевой кислоты на активность митохондриальных ферментов молодых и старых крыс изучалось в рамках нескольких работ. При ежедневном введении липоевой кислоты в течение 14 дней по 100 мг/кг у пожилых животных наблюдалось значительное (иногда незначительное) снижение активности различных ферментов цикла Кребса, а также комплексов I и IV в печени и почках по сравнению с животными группы контроля (245). Введение такой же дозы липоевой кислоты в течение 30 дней приводило к значительному повышению активности ферментов цикла Кребса и комплексов I, II, III и IV в митохондриях клеток мозга старых крыс (246). Аналогично описанным ранее митохондриальным нутриентам, липоевая кислота оказывает лишь незначительное положительное влияние на молодых животных.
Кроме альфа-кетоглутаратдегидрогеназы, непосредственно зависящей от липоевой кислоты, как от кофактора, активность других митохондриальных ферментов при введении животным липоевой кислоты также увеличивалась. Этот факт указывает на то, что липоевая кислота может выполнять в клетке и другие функции, например, оказывая влияние на антиоксидантный статус и улучшая таким образом митохондриальную биоэнергетику.
В противоположность результатам, полученным на крысах, анализ посмертных образцов ткани мозга пожилых индивидуумов, а также пациентов с болезнью Альцгеймера и мультиинфарктной деменцией не выявил снижения активности сукцинатдегидрогеназы (SDH), что указывает на существование видоспецифичных отличий ассоциированных с возрастом нарушений митохондриальной биоэнергетики (247). Однако в посмертных образцах ткани пациентов с болезнью Альцгеймера и мультиинфарктной деменцией была снижена активность зависимого от липоевой кислоты комплекса пируватдегидрогеназы (PDG). Интересно, что стимулировать активность пируватдегидрогеназы с помощью липоевой кислоты можно было исключительно в образцах ткани пациентов с мультиинфарктной деменцией, но не с болезнью Альцгеймера. Более того, исходя из наблюдения, что активность сукцинатдегидрогеназы не отличается ни в нормальных условиях, ни при стимуляции как в контрольных образцах, так и в образцах пациентов с мультиинфарктной деменцией и болезнью Альцгеймера, можно сделать следующие выводы: 1) утрата митохондрий не объясняет снижение активности пируватдегидрогеназы и 2) избирательная чувствительность пируватдегидрогеназы (и, возможно, других митохондриальных ферментов) может быть обусловлена прямым или косвенным, связанным с заболеванием, структурным и/или функциональным нарушением ферментов (248).
Так как митохондриальный биогенез в значительной степени зависит от регуляторного действия PGC-1-alpha (активируемый пролифераторами пероксисом рецептор-гамма-коактиватор-1-альфа), наблюдение, согласно которому липоевая кислота (так же, как, например, ресвератрол) способна стимулировать опосредуемый PGC-1-alpha сигнальный механизм и за счет этого повышать содержание мтДНК и белков, предоставляет новый перспективный подход к детальному изучению возможных эффектов липоевой кислоты в предотвращении нарушения работы митохондрий (249).
4.1.3.2.2. Влияние на антиоксидантную защиту
Липоевая и дигидролипоевая кислоты описаны как наиболее универсальная антиоксидантная пара. Это утверждение основано на том факте, что либо оба, либо, по крайней мере, одно из соединений могут взаимодействовать со всеми важными свободными радикалами и другими АФК (241,250,251). Более того, липоевая и дигидролипоевая кислоты могут запускать повторное использование других экзо- и эндогенных антиоксидантов, таких как витамины С и Е, CoQ10 и глутатион (241,252).
Данные, согласно которым липоевая кислота проявляет антиоксидантную активность in vivo , по большей части получены в результате количественного анализа биомаркеров окислительного стресса. Образцы плазмы и органов, полученные от животных, употреблявших липоевую кислоту, продемонстрировали повышенные уровни глутатиона (253,254) и витаминов С и Е (255-258), сниженную продукцию АФК (255), меньший липидный груз (257,259) и меньшую степень окисления ДНК (255), а также меньшее количество повреждений мтДНК (246). К методам, использованным в вышеупомянутых работах, относятся высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией для оценки повреждений ДНК (8-oxo-dG), использование флуоресцентного красителя 2'-7'-дихлорофлуоресцеина (DCF) для оценки продукции АФК, а также применение FOX для оценки уровней гидропероксидов липидов. Несмотря на то, что ряд ошибок может влиять на точность всех этих методов (15), все полученные данные свидетельствуют о наличии антиоксидантных эффектов.
С другой стороны, in vitro может наблюдаться проокислительная активность, характерная главным образом для дигидролипоевой кислоты (250). Очень мало известно о потенциально пагубном влиянии липоевой/дигидролипоевой кислот на животных и человека in vivo . Тогда как субхроническое лечение старых крыс липоевой кислотой вызывало усиление окисления белков и нитрирования в мозге (но не в мышцах) (259), увеличивающее продолжительность жизни влияние липоевой кислоты на дрозофил (260) и червей C.elegans (261) указывает на положительные метаболические изменения липоевой кислоты в ассоциации с процессом старения.
4.1.3.3. Исследования воздействия на человека в отношении старения и ассоциированных с возрастом заболеваний
В 60-х годах липоевую кислоту впервые использовали как терапевтический агент при лечении пациентов с циррозом печени, симптомами интоксикации и, в особенности, диабетической полиневропатией (243). Применение липоевой кислоты при диабете для предупреждения полиневропатических осложнений и ассоциированных с окислительным стрессом повреждений обосновано лишь небольшим количеством клинических данных (262-264). Антиоксидантные эффекты липоевой кислоты у диабетиков с альбуминурией и плохим гликемическим контролем даже сохранялись в течение некоторого времени (265). Эффективность липоевой кислоты для предотвращения и/или симптоматического лечения хронических ассоциированных с возрастом сердечно-сосудистых заболеваний и слабоумия, напротив, еще следует доказать. В обзоре Кокрановского Сотрудничества, опубликованном в 2007 году, сделан следующий вывод: липоевую кислоту нельзя рекомендовать пациентам с нарушениями познавательной функции из-за отсутствия результатов научно обоснованных рандомизированных клинических испытаний, проведенных двойным слепым методом под контролем плацебо (266).
Существует много информации о многостороннем влиянии липоевой/дигидролипоевой кислот in vitro и на животные модели сердечно-сосудистых заболеваний(267). Однако, так как эффекты приема липоевой кислоты изучены только в рамках нескольких маломасштабных клинических испытаний, на сегодняшний день невозможно делать выводы об эффективности ее использования для подавления симптомов и патологических механизмов, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями (267).
4.2. Сравнение комбинированного и раздельного приема митохондриальных нутриентов
Так как L-карнитин/ацетил-L-карнитин, CoQ10 и липоевая кислота участвуют в управлении митохондриальной биоэнергетикой и антиоксидантной защитой, высказано предположение, что прием комбинации двух или более митохондриальных нутриентов может обладать более высокой эффективностью по сравнению с приемом этих соединений по отдельности. К сожалению, только несколько авторов попытались сравнить эффекты раздельного и комбинированного приема митохондриальных нутриентов в отношении биомаркеров окислительного стресса и, например, познавательных функций, таких как различные типы обучения. В экспериментах на крысах Hagen et al. (198) продемонстрировали, что одновременное введение L-карнитина и ацетил-L-карнитина подавляло как ассоциированное с возрастом снижение уровня витамина С в печени, так и усиление перекисного окисления липидов (оценку проводили методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии для модифицированного пентофлуорофенилом малонового диальдегида), что указывает на возможное синергическое действие этих двух нутриентов (198). При дальнейшем изучении влияния L-карнитина, ацетил-L-карнитина и их комбинации на ассоциированные с возрастом изменения у крыс эта же группа авторов выявила более высокую активность приема комбинации соединений, по сравнению с приемом L-карнитина и ацетил-L-карнитина по отдельности, в отношении некоторых (но не всех) параметров, связанных с окислительным стрессом и состоянием познавательной функции (172, 268). Однако, поскольку прием ацетил-L-карнитина может стимулировать окислительный стресс в форме перекисного окисления липидов и снижать уровень обладающего антиоксидантными свойствами витамина С как у молодых, так и у старых крыс (см. выше (198)), очень трудно определить, действительно ли комбинация L-карнитина и ацетил-L-карнитина обладает усиленным эффектом за счет синергического действия, либо часть эффективности L-карнитина расходуется на нейтрализацию отрицательных метаболических эффектов ацетил-L-карнитина.
Аналогично, результаты внимательного повторного анализа двух массивов данных (рис. 3), недавно предоставленных другой группой исследователей, подвергают сомнению утверждение, что совместный прием липоевой кислоты и, в данном случае, L-карнитина обладает более выраженным эффектом по сравнению с приемом отдельных митохондриальных нутриентов (182,269).
Применение L-карнитина в обеих работах замедляло ассоциированное с возрастом снижение активности митохондриальных ферментов в клетках сердца (рис. 3), и авторы утверждают, что введение старым крысам L-карнитина и липоевой кислоты в течение 30 дней приводило к дальнейшему улучшению активности митохондриальных ферментов, значительно превосходящему эффекты приема одного L-карнитина. Однако эффекты, оказываемые комбинацией L-карнитина и липоевой кислоты, в работе II не отличаются от эффектов, выявленных при проведении работы I, в рамках которой оценивали эффекты применения одного L-карнитина (в течение 21 дня). На основе предоставленной информации, возраст животных, а также способ введения и дозировка L-карнитина и липоевой кислоты не отличались при проведении обеих работ, что минимизирует влияние отличий, кроме незначительной разницы в продолжительности исследований, на противоречивость данных. Однако пероральный прием L-карнитина в комбинации с N-ацетилцистеином и S-аденозилметионином улучшал познавательную функцию и снижал агрессию у взрослых мышей, экспрессирующих человеческий ген четвертого типа аполипопротеина Е (ApoE4), являющегося фактором риска развития болезни Альцгеймера. В этом случае состояние познавательной функции мышей дикого типа также улучшалось при приеме комбинации нутриентов (270).
Таким образом, на сегодняшний день существует очень ограниченное количество доказательств того, что комбинированный прием митохондриальных нутриентов может оказывать совокупное или даже синергическое положительное влияние на здоровье in vivo , а расхождения результатов, полученных разными лабораториями, требуют особого внимания.
Рис. 3. Влияние приема L-карнитина (LС) по сравнению с приемом комбинации LС и липоевой кислоты (LA) на ферментативную активность альфакетоглутаратдегидрогеназы (alpha-KGD), изоцитратдегидрогеназы (ICD), малатдегидрогеназы (MD) и сукцинатдегидрогеназы (SD) на сердце молодых и старых крыс. Данные взяты из Kumaran et al. (182) и Savitha et al. (269). Исследование I: прием LC (300 мг/кг) в течение 21 дня; исследование II: прием LC (300 мг/кг) в течение 30 дней и прием комбинации LC (300 мг/кг) и LA (100 мг/кг) в течение 30 дней
# - достоверно отличается от молодых животных группы контроля (иссл. I);
±±- достоверно отличается от молодых животных группы контроля (иссл. II);
а - достоверно отличается от старых животных группы контроля (иссл. I);
b - достоверно отличается от старых животных группы контроля (иссл. II);
с - достоверно отличается от старых животных группы контроля (иссл. II);
* - достоверно отличается от старых животных, принимавших LC (иссл. II).
Следует отметить сходные эффекты LC(иссл. I) и комбинации LC LA (иссл. II), а также предполагаемое наиболее выраженное влияние использования только LC(иссл. I по сравнению с иссл. II) на ферментативную активность у старых животных.
4.3. Антиоксиданты - немного общей информации
Обязательным условием того, чтобы антиоксидантная терапия оказала выраженное защитное действие против окислительного повреждения мтДНК, является создание достаточно высокой концентрации применяемых антиоксидантов в непосредственной близости от мтДНК, что необходимо для поглощения АФК с высокой эффективностью. Даже несмотря на существование ряда доказательств защитного действия классических антиоксидантов (55,60,271) и митохондриальных нутриентов (см. выше) в отношении мтДНК, любая стратегия применения антиоксидантов выиграет от «прицельного» подхода, обеспечивающего избирательное накопление антиоксидантов в митохондриях.
Этот вывод подтверждается тем фактом, что в исследованиях на животных, в рамках которых ученые пытались замедлить старение млекопитающих с помощью классических (не обладающих направленным действием) антиоксидантов, не получено четких доказательств их влияния на максимальную продолжительность жизни (10,15,223,272,273). Альтернативным объяснением является то, что большинство изучаемых соединений может не оказывать мощного антиоксидантного действия in vivo , что в действительности распространяется на большинство принимаемых человеком антиоксидантных добавок (274,275). Это не отрицает полезного действия антиоксидантов в контексте возрастных заболеваний. Многие развивающиеся по мере старения патологии, в том числе нейродегенеративные заболевания, такие как болезни Альцгеймера и Паркинсона, ассоциированы с усилением воспалительных процессов и окислительного повреждения (15,35). Если ученым удастся идентифицировать пригодные для использования in vivo антиоксиданты, то есть соединения, действительно обладающие антиоксидантными свойствами in vivo и способные проникать в ткани мозга, антиоксидантная терапия будет оказывать благотворное действие на пациентов с подобными заболеваниями.
Специалисты работают над созданием прицельно действующих на митохондрии антиоксидантов путем конъюгации липофильного катиона с различными антиоксидантными группами (276). Одно из таких соединений, mitoQ - избирательно действующее на митохондрии производное убихинона - демонстрирует избирательное накопление в митохондриях, с повышением концентрации в несколько сотен раз (276,277). Описаны также другие стратегии прицельного введения соединений в митохондрии (278). Однако необходимо помнить, что в некоторых случаях, в зависимости от условий окружающей среды, антиоксиданты могут выступать в роли потенциальных про-окислителей (15). Этот факт является потенциальной проблемой, в особенности касающейся митохондрий, из-за непосредственной близости многочисленных доноров и акцепторов электронов. В этом контексте интересно отметить, что в некоторых системах mitoQ претерпевает циклические окислительно-восстановительные изменения, выступая в роли про-окислителя, стимулируя продукцию супероксида и гибель клеток (279,280).
И, наконец, еще более усложняет картину тот факт, что АФК являются важными сигнальными молекулами, в функции которых, кроме всего прочего, входит участие в росте и пролиферации клеток, и тотальное снижение уровня АФК до нефизиологически низких значений обуславливает (по крайней мере, теоретически) возможность развития непреднамеренных побочных эффектов, например, подавления пролиферации клеток (7,158).
Несмотря на эти проблемы, возможность избирательно направлять действие антиоксидантов, зондов и модуляторов цепи переноса электронов на митохондрии открывает новые возможности в манипулировании функциями митохондрий и продукцией АФК in vivo , делая эту область перспективным направлением исследовательской работы.
5. Выводы и перспективы
Учитывая то, что дегенерация митохондрий и утрата целостности мтДНК задействованы в развитии возрастных дегенеративных процессов, митохондрии представляют собой привлекательную мишень для попыток предотвращения или замедления развития возрастных патологий и, возможно, даже для модулирования базальной скорости старения.
На сегодняшний день большинство таких подходов, как теоретических, так и практических, основано на предположении, что снижение уровня или поглощение митохондриальных АФК защитит функциональную активность митохондрий и целостность мтДНК. Как уже обсуждалось ранее, попытки достижения этого на практике заключались в использовании митохондриальных нутриентов, а также классических и некоторых прицельно действующих антиоксидантов. Ряд исследований in vitro продемонстрировал, что митохондриальные нутриенты, а также прицельно действующие антиоксиданты способны предотвратить или даже спасти клетку от разрушительного действия агентов, пагубно влияющих на митохондрии.
Однако данные, полученные в экспериментах на культурах клеток, очень легко неправильно интерпретировать (80, 281), так как культивирование животных и человеческих клеток является очень сложным процессом, чреватым появлением артефактов. Например, слишком высокая или слишком низкая эффективность высева клеток на пластик оказывает выраженные эффекты на формирование здоровой популяции одних и тех же клеток и, соответственно, на результаты эксперимента. Более того, использование различных сред для культивирования клеток может приводить к получению нерелевантных положительных или отрицательных результатов из-за взаимодействия между культуральной средой и тестируемым веществом, что, кроме других побочных эффектов, может неожиданно вызвать развитие окислительного стресса (80, 282). Появление артефактов еще более усугубляется использованием превышающих физиологические значения концентраций изучаемого соединения (283). Более того, тот факт, что клетки обычно культивируют в условиях сильного избытка кислорода, может вызвать несоразмерно высокую продукцию АФК (80).
Согласно полученным в экспериментах in vivo данным, у животных, получающих митохондриальные нутриенты, часто наблюдается усиление биоэнергетики митохондрий и улучшение параметров связанного с возрастом ослабления функций. В отличие от этой доказанной эффективности поддержания и частичного восстановления митохондриальной продукции энергии, существует мало данных в пользу того, что доступные митохондриальные нутриенты и антиоксиданты могут предотвращать повреждение мтДНК и снижать мутационный груз in vivo (200,246). Результаты дальнейшей работы с митохондриальными нутриентами и обладающими прицельным действием антиоксидантами должны показать, действительно ли эти соединения являются эффективными митохондриальными антиоксидантами, т.е. способны ли какие-либо из них значительно уменьшать окислительное повреждение митохондрий и, в особенности, мтДНК in vivo . Более фундаментальным вопросом является следующий: способно ли поддерживаемое в течение всей жизни подавление окислительного повреждения мтДНК воспроизводить фенотип, наблюдаемый у мышей линии МСАТ, а именно, можно ли перенести это на значительное снижение мутационного груза мтДНК in vivo и увеличение продолжительности жизни. Изучение этого вопроса предоставит новую важную информацию о механизмах, лежащих в основе связанного с возрастом износа митохондрий и организма в целом. Кроме отдельных фактов (284) на сегодняшний день не существует убедительных данных, подтверждающих, что регулярный прием человеком митохондриальных нутриентов предотвращает развитие ассоциированных с возрастом заболеваний и, тем более, замедляет процесс старения.
Альтернативным подходом к модулированию митохондриальной продукции АФК является манипулирование с потенциалом митохондриальной мембраны, например, посредством слабой активации механизма разобщения (285,286). Умеренное снижение потенциала митохондриальной мембраны ведет к значительному снижению проникновения АФК, что можно рассматривать как уменьшение груза повреждений мтДНК. Однако, в конечном счете, любой подход, направленный на снижение нагрузки АФК посредством их нейтрализации или «метаболической настройки», будет осложнен замысловатостью вовлеченных систем обратной связи, наглядным примером которой является двойственная роль АФК в сигнальных механизмах. Любая такая попытка изменить ограниченное количество желаемых параметров без запуска нежелательных побочных или компенсаторных эффектов в действительности является очень сложной задачей в контексте замысловатой системы тесно взаимосвязанных процессов. Более того, предотвращение опосредуемого АФК повреждения никогда не будет совершенным, а механизмы независимой от АФК клональной экспансии могут привести к увеличению уровня любых повреждений мтДНК до физиологически значимых значений.
В качестве возможного решения предложено непосредственное воздействие на механизмы повреждений вместо попыток модулирования скорости их накопления. Скорее всего, этот подход не вызовет пагубных эффектов в результате непредвиденных клеточных реакций, которыми чреваты вмешательства в метаболизм (287). Другой класс стратегий, направленных на снижение продолжающегося всю жизнь накопления окислительных повреждений, основан на усилении эндогенных систем антиоксидантной защиты и детоксикации, либо активации механизмов обновления и восстановления повреждений. Такая активация эндогенных защитных резервов продемонстрирована, например, как реакция на гормезис (стимуляцию какой-либо системы организма внешними воздействиями с интенсивностью, недостаточной для проявления вредных факторов) (описано в (288)), а также во взаимосвязи с генетическими вмешательствами, модулирующими процессы старения (289,290). Фармакологические стратегии могут использовать эти эндогенные резервы либо посредством прямого взаимодействия с соответствующими сигнальными механизмами, либо посредством копирования действия стрессоров без причинения реального вреда. В будущем должны появиться новые подходы, основанные на растущем понимании механизмов, лежащих в основе действия ограничения калорийности рациона, клональной экспансии мутаций мтДНК, восстановления мтДНК, митогенеза и обновления митохондрий.
Список литературы см. в отдельном файле.