Мезенхимальные стволовые клетки

Среди регионарных стволовых клеток особое место занимают мезенхимальные стволовые клетки (МСК), производные которых составляют стромальную матрицу всех органов и тканей организма человека. Приоритет в исследованиях МСК принадлежит представителям российской биологической науки.

В середине прошлого века в лаборатории А. Фриденштейна впервые была выделена однородная культура мультипотентных стромальных стволовых клеток костного мозга. Мезенхимальные стволовые клетки, прикрепленные к подложке, длительное время сохраняли высокую интенсивность пролиферации, а в культурах при низкой плотности посева после фиксации на подложке образовывали клоны фибробластоподобных клеток, не обладающих фагоцитарной Активностью. Остановка пролиферации МСК завершалась их спонтанной дифференцировкой in vitro в клетки костной, жировой, хрящевой, мышечной или соединительной ткани. Дальнейшие исследования позволили установить остеогенный потенциал фибробластоподобных клеток стромы костного мозга различных видов млекопитающих, а также их колониеобразующую активность. В экспериментах in vivo было показано, что как гетеро-, так и ортотопическая трансплантация колониеобразующих фибробластоподобных клеток завершается формированием костной, хрящевой, фиброзной и жировой ткани. Поскольку стромальные стволовые клетки костного мозга отличаются высокой способностью к самообновлению и многоплановостью дифференцировки в пределах одной клеточной линии, они получили название мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников.

Надо заметить, что за 45 лет фундаментальных исследований мезенхимальных стволовых клеток созданы реальные условия для применения их производных в клинической практике.

Сегодня уже нет никаких сомнений, что все ткани организма человека образуются из стволовых клеток различных клеточных линий в результате процессов пролиферации, миграции, дифференцировки и созревания. Однако еще совсем недавно считалось, что стволовые клетки во взрослом организме тканеспецифичны, то есть, способны производить линии специализированных клеток только тех тканей, в которых они находятся. Это концептуальное положение было опровергнуто фактами трансформации гемопоэтических стволовых клеток не только в клеточные элементы периферической крови, но и в овальные клетки печени. Кроме того, и нейральные стволовые клетки оказались способными давать начало как нейронам и глиальным элементам, так и ранним коммитированным линиям клеток-предшественников гемопоэза. В свою очередь, мезенхимальные стволовые клетки, обычно продуцирующие клеточные элементы костной, хрящевой и жировой ткани, способны трансформироваться в нейральные стволовые клетки. Предполагается, что в процессе роста, физиологической и репаративной регенерации тканей некоммитированные клетки-предшественники генерируются из тканенеспецифичных стволовых резервов. Например, репарация мышечной ткани может реализовываться за счет мезенхимальных стволовых клеток, мигрирующих из костного мозга в скелетную мускулатуру.

Хотя такую перекрестную взаимозаменяемость стволовых клеток признают далеко не все исследователи, возможность клинического использования мезенхимальных стволовых клеток в качестве источника для клеточной трансплантации и клеточного вектора генетической информации уже никем не оспаривается, как и мультипотентность стромальных стволовых клеток костного мозга, которые можно относительно легко изолировать и размножить в культуре in vitro. В то же время в научной литературе продолжают появляться сообщения о потенциальной плюрипотентности стволовых клеток стромы костного мозга. В качестве доказательства приводятся протоколы исследований, в которых под воздействием специфических индукторов трансдифференцировки МСК преобразуются в нервные клетки, кардиомиоциты и гепатоциты. Однако у некоторых ученых возможность повторной активации и экспрессии генов периода раннего эмбриогенеза вызывает большие сомнения. При этом все понимают, что если будут найдены условия для расширения мультипотентности мезенхимальных стволовых клеток до плюрипотентности ЭСК, в регенеративно-пластической медицине автоматически разрешаются многие проблемы этического, морального, религиозного и юридического характера. Кроме того, поскольку в этом случае источником регенеративного стволового потенциала становятся аутологичные стромальные клетки больного, решается и проблема иммунного отторжения клеточного трансплантата. Насколько реальны эти перспективы, покажет ближайшее будущее.

Источники мезенхимальных стволовых клеток

Основным источником мезенхимальных стволовых клеток является костный мозг, гемопоэтические стволовые клетки которого в организме млекопитающих постоянно дифференцируются в клетки крови и иммунной системы, тогда как мезенхимальные стволовые клетки представлены немногочисленной популяцией фибробластоподобных клеток стромы костного мозга и способствуют сохранению недифференцированного состояния кроветворных стволовых клеток. В определенных условиях мезенхимальные стволовые клетки дифференцируются в клетки хрящевой и костной ткани. При посеве на культуральную среду в условиях низкой плотности посадки мононуклеарные стромальные клетки костного мозга формируют колонии адгезивных клеток, которые, собственно, и являются фибробластоподобными мультипотентными мезенхимальными клетками-предшественниками. Некоторые авторы полагают, что в костном мозге депонируются некоммитированные мезенхимальные стволовые клетки, которые, благодаря способности к самообновлению и высокому дифференцировочному потенциалу, обеспечивают все ткани организма мезенхимальными предшественниками стромальных элементов на протяжении всей жизни организма млекопитающих.

В костном мозге стромальные клеточные элементы формируют сеть, заполняющую пространство между синусоидами и костной тканью. Содержание дормантных МСК в костном мозге взрослого человека сопоставимо с количеством гемопоэтических стволовых клеток и не превышает 0,01-0,001%. Мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из костного мозга и не подвергавшиеся культивированию, лишены адгезивных молекул. Такие МСК не экспрессируют CD34, ICAM, VCAM, коллаген I и III типов, CD44 и CD29. Следовательно, in vitro на подложке культуры фиксируются не мезенхимальные стволовые клетки, а более продвинутые прогениторные производные мезенхимальных стволовых клеток, уже сформировавшие компоненты цитоскелета и рецепторного аппарата молекул клеточной адгезии. Стромальные клетки с фенотипом CD34 обнаружены даже в периферической крови, хотя в костном мозге их значительно меньше, чем СD34-позитивных мононуклеаров. Выделенные из крови и переведенные в культуру СD34-клетки прикрепляются к подложке и образуют колонии фибробластоподобных клеток.

Известно, что в эмбриональном периоде стромальная основа всех органов и тканей млекопитающих и человека возникает из общего пула мезенхимальных стволовых клеток до начала и на стадии органогенеза. Поэтому считается, что в зрелом организме большая часть мезенхимальных стволовых клеток должна находиться в соединительной и костной ткани. Установлено, что основная часть клеточных элементов стромы рыхлой соединительной и костной ткани представлена коммитированными прогениторными клетками, которые, однако, сохраняют способность к пролиферации и формированию клонов in vitro. При введении таких клеток в общий кровоток более 20% мезенхимальных прогениторных клеток имплантируются среди стромальных элементов кроветворной ткани и паренхиматозных органов.

Потенциальным источником мезенхимальных стволовых клеток является жировая ткань, среди стволовых клеток которой выявлены коммитированные в разной степени предшественники адипоцитов. Наименее зрелые прогениторные элементы жировой ткани - стромально-сосудистые клетки, которые так же, как и мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга, способны дифференцироваться в адипоциты под воздействием глюкокортикоидов, инсулиноподобного фактора роста и инсулина. В культуре стромально-сосудистые клетки дифференцируются в адипоциты и хондроциты, а в жировой ткани костномозгового происхождения имеются клетки, образующие адипоциты и остеобласты.

В мышцах также обнаружены стромальные стволовые источники. В первичной культуре клеток, выделенных из скелетной мускулатуры человека, выявляются клетки звездчатой формы и многоядерные миотрубочки. В присутствии лошадиной сыворотки звездчатые клетки пролиферируют in vitro без признаков цитодифференцировки, а после добавления в питательную среду дексаметазона их дифференцировка характеризуется появлением клеточных элементов с фенотипом клеток скелетных и гладких мышц, костной, хрящевой и жировой ткани. Следовательно, в мышечной ткани человека представлены как коммитированные, так и некоммитированные мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники. При этом показано, что популяция клеток-предшественников, представленных в скелетной мускулатуре, происходит от некоммитированных мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников костного мозга и отличается от миогенных сателлитных клеток.

В миокарде новорожденных крыс также обнаружены адгезивные звездчатые клетки, соответствующие по дифференцировочному потенциалу мультипотентным мезенхимальным прогениторным клеткам, поскольку под влиянием дексаметазона они дифференцируются в адипоциты, остеобласты, хондроциты, гладкомышечные клетки, миотрубочки скелетных мышц и кардиомиоциты. Показано, что сосудистые гладкомышечные клетки (перициты) являются производными недифференцированных периваскулярных мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников. В культуре периваскулярные мезенхимальные стволовые клетки экспрессируют а-актин гладких мышц и рецептор тромбоцитарного фактора роста и способны дифференцироваться по крайней мере в гладкомышечные клетки.

Особое место, с точки зрения стволовых резервов, занимает хрящевая ткань, крайне низкий репаративный потенциал которой, как полагают, обусловлен дефицитом мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников или дифференцировочных и ростовых факторов. Допускается, что прекоммитированные к хондро- и остеогенезу мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники поступают в хрящевую ткань из других тканевых источников.

Тканевое происхождение и условия коммитирования мезенхимальных клеток-предшественников в сухожилиях также не установлены. Эксперментальные наблюдения свидетельствуют, что в раннем постнатальном периоде клетки ахиллова сухожилия кроликов в первичных культурах и при первом пассаже сохраняют экспрессию коллагена I типа и декорина, однако при дальнейшем культивировании они теряют дифференцировочные маркеры теноцитов.

Надо заметить, что ответ на вопрос, действительно ли локализованные в различных тканях мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники постоянно присутствуют в их строме, или же тканевой пул мезенхимальных стволовых клеток восполняется за счет миграции стромальных стволовых клеток костного мозга, все еще не получен.

Кроме костного мозга и других мезенхимальных тканевых зон взрослого организма еще одним источником МСК может быть кордовая кровь. Показано, что кровь пуповинной вены содержит клетки, которые имеют схожие морфологические и антигенные характеристики с мультипотентными мезенхимальными клетками-предшественниками, способны к адгезии и не уступают мультипотентным мезенхимальным клеткам-предшественникам костномозгового происхождения по дифференцировочному потенциалу. В культурах мезенхимальных стволовых клеток пуповинной крови обнаружено от 5 до 10% некоммитированных мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников. Оказалось, что их количество в кордовой крови обратно пропорционально сроку гестации, что косвенно свидетельствует о миграции мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников в различные ткани в процессе развития плода. Появились первые сведения о клиническом применении мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из пуповинной крови, а также полученных из эмбрионального биоматериала, что основано на известной способности фетальных стволовых клеток интегрироваться, приживляться и функционировать в органах и тканевых системах взрослых реципиентов.

Поиски новых источников мезенхимальных стволовых клеток

Применение мезенхимальных стволовых клеток эмбрионального происхождения, как и других фетальных клеток, создает целый ряд этических, правовых, юридических и законодательных проблем. Поэтому поиск внеэмбрионального клеточного донорского материала продолжается. Неудачной оказалась попытка клинического применения фибробластов кожи человека, что было предопределено не только высокой финансовой емкостью технологии, но и быстрой дифференцировкой фибробластов в фиброциты, имеющих значительно меньший потенциал пролиферации и продуцирующих ограниченное количество факторов роста. Дальнейший прогресс в области изучения биологии МСК и мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников костного мозга позволил разработать стратегию клинического использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток. Технология их выделения, культивирования, размножения ex vivo и направленной дифференцировки требовала, прежде всего, изучения спектра молекулярных маркеров МСК. Их анализ показал, что в первичных культурах костной ткани человека имеются несколько типов мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников. Фенотип проостеобластов обнаружен у клеток, экспрессирующих маркер стромальных клеток-предшественников STRO-1, но не несущих маркер остеобластов - щелочную фосфатазу. Такие клетки характеризуются низкой способностью к образованию минерализованного костного матрикса, а также отсутствием экспрессии остеопонтина и рецептора паратиреоидного гормона. Производные STRO-1-позитивных клеток, не экспрессирующие щелочную фосфатазу, представлены промежуточно и полностью дифференцированными остеобластами. Установлено, что клеточные элементы клонированных линий STRO-1-позитивных клеток трабекулярных костей человека способны дифференцироваться в зрелые остеоциты и адипоциты. Направление дифференцировки этих клеток зависит от воздействия полиненасыщенных жирных кислот, провоспалительных цитокинов - IL-1b и фактора некроза опухоли а (TNF-а), а также противовоспалительного и иммуносупрессивного TGF-b.

В дальнейшем оказалось, что мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники лишены специфичного, только им присущего фенотипа, но экспрессируют комплекс маркеров, характерных для мезенхимальных, эндотелиальных, эпителиальных и мышечных клеток при отсутствии экспрессии иммунофенотипических антигенов гемопоэтических клеток - CD45, CD34 и CD14. Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки конститутивно и индуцибельно продуцируют гемопоэтические и негемопоэтические ростовые факторы, интерлейкины и хемокины, а на мультипотентных мезенхимальных клетках-предшественниках экспрессируются рецепторы для некоторых цитокинов и ростовых факторов. Среди клеток стромальной основы организма человека обнаружены дормантные, или покоящиеся клетки с иммунофенотипом, почти идентичным антигенному профилю необработанных 5-фторурацилом мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников - и те, и другие клетки экспрессируют CD117, маркирующий "взрослые" стволовые клетки.

Таким образом, клеточный маркер, уникальный для мезенхимальных стволовых клеток, до сих пор не установлен. Допускается, что покоящиеся клетки представляют популяцию некоммитированных мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников, поскольку они не экспрессируют маркеры клеток, коммитированных к остео- (Cbfa-1) или адипогенезу (PPAR-y-2). Продолжительная экспозиция медленно пролиферирующих покоящихся клеток с эмбриональной телячьей сывороткой приводит к образованию терминально дифференцирующихся коммитированных предшественников, характеризующихся быстрым ростом. Клональный рост таких стволовых мезенхимальных клеток поддерживается FGF2. Похоже, что геном стромальных стволовых клеток достаточно плотно "закрыт". Имеются сообщения об отсутствии спонтанной дифференцировки у МСК - без специальных условий для коммитирования они не преобразуются даже в клетки мезенхимального ряда.

Для изучения популяционной структуры производных мезенхимальных стволовых клеток проводится поиск маркерных дифференцировочных белков на стромальных клеточных линиях и в первичных культурах. При клональном анализе колониеобразующих клеток костного мозга in vitro установлено, что при воздействии на первичные культуры EGF увеличивает средний размер колоний и уменьшает клональную экспрессию щелочной фосфатазы, тогда как добавление гидрокортизона активирует экспрессию щелочной фосфатазы, которая является маркером остеогенной направленности дифференцировки МСК. Моноклональные антитела к STRO-1 сделали возможным разделение и изучение популяции STRO-1-позитивных адгезивных клеток в гетерогенной системе декстеровских культур. Определен спектр цитокинов, регулирующих не только пролиферацию и дифференцировку кроветворных и лимфоидных клеток, но и участвующих в формировании, образовании и резорбции скелетных тканей посредством пара-, ауто- и эндокринных механизмов. Опосредованное рецепторами высвобождение таких вторичных мессенджеров, как цАМФ, диацилглицерол, инозитолтрифосфат и Са2+, также используется для маркерного анализа различных категорий клеток стромальных тканей, экспрессирующих соответствующие рецепторы. Применение моноклональных антител в качестве маркеров позволило установить принадлежность ретикулярных клеток стромы лимфоидных органов к Т- и В-зависимым зонам.

Какое-то время продолжались научные споры вокруг вопроса о возможности происхождения МСК из гемопоэтической стволовой клетки. Действительно, при эксплантации взвеси костномозговых клеток в монослойные культуры в них вырастают дискретные колонии фибробластов. Однако было показано, что наличие предшественников фибробластных колоний и различных ростков дифференцировки гемопоэтической ткани в составе костного мозга не является доказательством их общего происхождения из стволовой кроветворной клетки. С помощью дискриминантного анализа костномозговых стволовых клеток установлено, что микроокружение при гетеротопной трансплантации костного мозга переносится не гемопоэтическими клетками, что доказывает существование, в костном мозге гистогенетически независимой от кроветворных клеток популяции МСК.

Кроме того, метод избирательного клонирования позволил выявить в монослойных культурах костномозговых клеток новую категорию стромальных клеток-предшественников, определить их численность, изучить их свойства, пролиферативные и дифференцировочные потенции. Оказалось, что стромальные фибробластоподобные клетки in vitro пролиферируют и образуют диплоидные колонии, которые при обратной трансплантации в организм обеспечивают формирование новых кроветворных органов. Результаты исследования отдельных клонов свидетельствуют о том, что среди стромальных клеток-предшественников присутствует популяция клеток, по своему пролиферативному и дифференцировочному потенциалу способная претендовать на роль стволовых клеток стромальной ткани, гистогенетически не зависимой от стволовых кроветворных клеток. Клетки этой популяции характеризуются самоподдерживающимся ростом и дифференцируются в прогениторные клеточные элементы костной, хрящевой и ретикулярной ткани костного мозга.

Большой интерес представляют результаты исследований Р. Чайлахяна и соавторов (1997-2001), которые культивировали костномозговые стромальные клетки-предшественники кроликов, морских свинок и мышей на питательной среде а-МЕМ с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки. Эксплантацию авторы проводили с исходной плотностью 2-4 х 103 клеток костного мозга на 1 см2. В качестве фидера использовали гомологичные или гетерологичные инактивированные облучением клетки костного мозга в дозе, сохраняющей фидерное действие, но полностью блокирующей их пролиферацию. Двухнедельные первичные дискретные колонии фибробластов трипсинизировались для получения моноклональных штаммов. Доказательства клонального происхождения колоний были получены с помощью хромосомного маркера в смешанных культурах костного мозга самца и самок морских свинок, цейтраферной съемки живых культур, а также в смешанных культурах сингенного костного мозга мышей СВА и СВАТ6Т6. Трансплантация взвеси свежевыделенных клеток костного мозга или выращенных in vitro стромальных фибробластов под капсулу почки проводилась в ивалоновых или желатиновых пористых каркасах, а также в инактивированном кроличьем губчатом костном матриксе. Для трансплантации клонов в костном чехле бедренные кости морской свинки очищали от мягких тканей и надкостницы, обрезали эпифизы и тщательно вымывали костный мозг. Кость нарезали на фрагменты (3-5 мм), высушивали и подвергали облучению в дозе 60 Гр. В костные чехлы помещали индивидуальные колонии фибробластов и имплантировали внутримышечно. Для внутрибрюшинной трансплантации стромальных фибробластов, выращенных in vitro, использовались диффузионные камеры типов А (V=0,015 см3, h=0,l мм) и О (V=0,15 см3, h=2 мм).

При изучении динамики роста клональных штаммов Р. Чайлахян и соавторы (2001) установили, что отдельные клетки, образующие колонии фибробластов, а также их потомки обладают огромным пролиферативным потенциалом. К 10-му пассажу численность фибробластов в некоторых штаммах составляла 1,2-7,2 х 10⁹ клеток. В процессе своего развития они осуществляли до 31-34 клеточных удвоений. При этом гетеротопная трансплантация штаммов костномозгового происхождения, сформированных стромальными предшественниками нескольких десятков клонов, приводила к переносу костномозгового микроокружения и образованию в зоне трансплантации нового кроветворного органа. Авторы поставили вопрос о том, способны ли отдельные клоны переносить костномозговое микроокружение стромальных клеток или для этого требуется кооперация нескольких разных клоногенных стромальных предшественников? И если отдельные клоны окажутся способными к переносу микроокружения, будет ли оно полноценным для всех трех ростков кроветворения, или разные клоны обеспечивают формирование микроокружения для разных кроветворных ростков? Для решения этих вопросов была разработана технология культивирования стромальных клеток-предшественников на коллагеновом геле, позволяющая снимать с поверхности выращенные колонии фибробластов для последующей гетеротопной трансплантации. Отдельные клоны стромальных фибробластов, выращенные из костномозговых клеток мышей СВА и морских свинок, вырезались вместе с фрагментом гелевого покрытия и трансплантировались гетеротопно - под капсулу почек сингенных мышей или в мышцу живота аутологичных морских свинок. При трансплантации в мышцу колонии на геле помещали в костные чехлы.

Авторы установили, что через 50-90 дней после трансплантации колоний костномозговых фибробластов в 20% случаев в зоне пересадки наблюдалось развитие костной или костной и кроветворной ткани. У 5% животных-реципиентов образовавшиеся очаги костной ткани содержали полость, заполненную костным мозгом. Внутри костных цилиндров такие очаги имели округлую форму и капсулу, построенную из костной ткани с остеоцитами и хорошо развитым остеобластическим слоем. Костномозговая полость содержала ретикулярную ткань с миелоидными и эритроидными клетками, пропорциональное соотношение которых не отличалось от такового в обычном костном мозге. В почке трансплантат представлял собой типичный костномозговой орган, образующийся при пересадке нативного костного мозга, причем костная капсула покрывала костномозговую полость только со стороны почечной капсулы. Кроветворная ткань включала миелоидные, эритроидные и мегакариоцитарные элементы. Строма костномозговой полости имела хорошо развитую систему синусов и содержала типичные жировые клетки. В то же время в зоне трансплантации некоторых колоний под капсулой почки была обнаружена костная ткань без признаков кроветворения. Изучение пролиферативных и дифференцировочных потенций индивидуальных клонов было продолжено на моноклональных костномозговых штаммах кроликов, клетки которых ресуспензировали в питательной среде и в отдельной ивалоновой губке с массой 1-2 мг подсаживали под почечную капсулу кролика-донора костного мозга. Такой аутотрансплантации были подвергнуты клетки 21 моноклонального штамма. Результаты учитывали через 2-3 месяца. Авторы установили, что в 14% случаев пересаженные моноклональные штаммы образовывали костномозговой орган, состоящий из костной ткани и костномозговой полости, заполненной кроветворными клетками. В 33% наблюдений трансплантированные штаммы формировали компактную кость разной величины с замурованными в полостях остёоцитами и развитым остеобластическим слоем. В некоторых случаях в губках с трансплантированными клонами развивалась ретикулярная ткань без костных или кроветворных элементов. Иногда происходило формирование ретикулярной стромы с хорошо развитой сетью синусоидов, но не заселенной кроветворными клетками. Таким образом, полученные результаты оказались схожими с данными, полученными при трансплантации клонов на коллагеновом геле. Однако, если трансплантация клонов, выращенных на подложке, приводила к образованию костномозговой ткани в 5% случаев, костной - в 15% и ретикулярной ткани - в 80% случаев, то при трансплантации моноклональных штаммов формирование костномозговых элементов наблюдалось в 14% случаев, костных - в 53% и ретикулярных - в 53% случаев. По мнению авторов, это свидетельствует о том, что условия для реализации пролиферативных и дифференцировочных потенций стромальных фибробластов при трансплантации на пористых каркасах оказались оптимальнее, чем при их пересадке в костных чехлах и на коллагеновой подложке. Не исключено, что использование более совершенных методов культивирования и обратной трансплантации клонов может улучшить условия для реализации клонами своих дифференцировочных потенций и изменить эти соотношения. Так или иначе, но основное значение проведенных исследований заключается в том, что часть клонов стромальных клеток способна формировать костную ткань и одновременно обеспечивать стромальное гемопоэтическое микроокружение сразу для трех ростков костномозгового кроветворения: эритроидного, миелоидного и мегакариоцитарного, создавая при этом достаточно большие плацдармы кроветворной ткани и некоторую костную массу.

Далее авторы решали вопрос о способности к данным типам клеточной дифференцировки отдельных клоногенных стромальных клеток-предшественников в условиях закрытой системы диффузионных камер. Кроме того, предстояло выяснить, обладают ли полипотентностью отдельные клоны, или же для проявления дифференцировочного потенциала необходимо кооперативное взаимодействие нескольких клонов с закрепленным признаком цитодифференцировки, различное соотношение которых определяет преимущественное формирование костной, ретикулярной или хрящевой ткани. Объединив два методических подхода - получение моноклональных штаммов костномозговых стромальных клеток-предшественников и трансплантацию их в диффузионные камеры, Р. Чайлахян и соавторы (2001) получили результаты, которые позволили приблизиться к пониманию структурной организации костномозговой стромы. Трансплантация моноклональных штаммов стромальных клеток-предшественников в камерах типа О приводила к образованию как костной, так и хрящевой ткани, что свидетельствует о способности потомков одной стромальной колониеобразующей клетки одновременно формировать костную и хрящевую ткань. Предположение о том, что костная и хрящевая ткань происходит от общей стромальной клетки-предшественника, ранее высказывалось неоднократно. Однако эта гипотеза не имела корректного экспериментального подтверждения. Образование кости и хряща в диффузионных камерах явилось необходимым доказательством существования среди стволовых клеток стромы костного мозга общей клетки-предшественника для этих двух типов ткани.

Затем 29 клональных штаммов второго-третьего пассажей, полученных из первичных культур костного мозга кролика, помещались в диффузионные камеры и имплантировались внутрибрюшинно гомологичным животным. Проведенные исследования показали, что 45% костномозговых моноклональных штаммов обладают остеогенными потенциями. Исключительно ретикулярную ткань содержали 9 камер, но вместе с костной и хрящевой тканью она присутствовала еще в 13 камерах, что составляло 76% всех штаммов. В камерах типа О, где была возможна дифференцировка как костной, так и хрящевой ткани, исследованы 16 штаммов. В четырех камерах (25%) формировалась как костная, так и хрящевая ткань. Следует еще раз отметить, что в исследованиях Р. Чайлахяна и соавторов (2001) отдельные клетки-предшественники претерпевали в составе клеточного штамма от 31 до 34 удвоений, а их потомство составило 0,9-2,0 х 10⁹ клеток. Количество митозов, которым подвергались клетки-предшественники поликлональных штаммов, практически не отличалось от такового у клеток моноклональных штаммов. При этом темп развития поликлональных штаммов, особенно в первой фазе их формирования, в существенной мере зависел от количества колоний, используемых для инициации штаммов. Диплоидные штаммы эмбриональных фибробластов человека (WI-38) при реклонировании на 12-15-м уровнях удвоения также формировали колонии, различающиеся по диаметру и содержанию в них клеток. Крупные колонии, содержащие более 103 клеток, составляли всего 5-10%. С увеличением количества делений процент крупных колоний снижался. Моно- и поликлональные штаммы стромальных костномозговых фибробластов сохраняли диплоидный набор хромосом после 20 и более удвоений, а тенденция их развития была сопоставима с динамикой развития диплоидных штаммов эмбриональных фибробластов. Анализ дифференцировочного потенциала отдельных костномозговых стромальных клеток-предшественников, проведенный путем трансплантации моноклональных штаммов в диффузионные камеры, показал, что половина из них остеогенные. Крупные колонии составили 10% от их общего числа. Следовательно, число остеогенных колониеобразующих клеток соответствовало примерно 5% от их общей популяции. В общей массе выявленных авторами остеогенных клеток-предшественников присутствовали клетки, способные формировать одновременно костную и хрящевую ткань. При этом впервые установлено, что для этих двух типов ткани во взрослом организме есть общая клетка-предшественник: 25% тестируемых клонов были созданы подобными клетками, а их численность среди общей популяции клеток-предшественников составляла не менее 2,5%.

Таким образом, гетеротопная трансплантация отдельных клонов костномозговых фибробластов открыла новые аспекты структурной организации популяции мезенхимальных клеток-предшественников. Обнаружены стромальные клетки-предшественники, способные переносить специфическое микроокружение сразу для всех ростков кроветворения, численность которых среди исследованных крупных клонов на разных моделях составляет от 5 до 15% (0,5-1,5% от общего числа выявляемых клеток-предшественников). Наряду с клонами, переносящими полное костномозговое микроокружение, присутствуют клетки-предшественники, детерминированные лишь к остеогенезу, образующие при переносе в открытой системе костную ткань, не поддерживающую развитие гемопоэза. Их численность от общего числа клеток-предшественников составляет 1,5-3%. Часть этих клеток способна формировать костную ткань с ограниченным сроком самоподдержания. Следовательно, популяция стромальных клеток-предшественников по своему дифференцировочному потенциалу является гетерогенной. Среди них имеется категория клеток, претендующих на роль стволовых стромальных клеток, способных дифференцироваться во всех трех направлениях, свойственных стромальной ткани костного мозга, образуя при этом костную, хрящевую и ретикулярную ткань. Приведенные данные позволяют надеяться, что с помощью различных клеточных маркеров удастся определить вклад каждого типа стромальных клеток в организацию специфического микроокружения и поддержку кроветворения в декстеровских культурах.

Особенности мезенхимальных стволовых клеток

В последние годы установлено, что в стационарных культурах костного мозга мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники представлены ограниченной популяцией мелких агранулярных клеток (RS-1-клетки), характеризующихся низкой способностью к колониеобразованию и отсутствием экспрессии антигена Ki-67, специфичного для пролиферирующих клеток. Антигенные параметры дормантных RS-1-клеток отличаются от спектра антигенов быстро пролиферирующих коммитированных стромальных клеток-предшественников. Установлено, что высокая скорость пролиферации коммитированных клеток-предшественников наблюдается только в присутствии RS-1-клеток. В свою очередь, RS-1-клетки увеличивают скорость роста под воздействием факторов, секретируемых наиболее зрелыми производными мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников. Создается впечатление, что RS-1-клетки являются подклассом некоммитированных МСК, способных к рециклингу. In vitro резистентные к 5-фторурацилу стромальные клетки-предшественники костного мозга характеризуются низким содержанием РНК и высоким уровнем экспрессии гена орнитиндекарбоксилазы - маркера непролиферирующих клеток.

Интенсивное размножение стромальных клеток-предшественников начинается после их фиксации на подложке. При этом экспрессируется маркерный профиль слабо дифференцированных клеток: SH2 (рецептор TGF-(3), SH3 (домен сигнального белка), коллаген I и III типов, фибронектин, рецепторы адгезии VCAM-1 (CD106) и ICAM (CD54), кадгерин-11, CD44, CD71 (рецептор трансферрина), CD90, CD120a и CD124, но без экспрессии характерных маркеров гемопоэтических стволовых клеток (CD34, CD14, CD45). Клональный рост дает возможность многократно пассировать мезенхимальные стволовые клетки с образованием в культуре многочисленных генетически однородных стромальных прогениторных плюрипотентных клеток. Через 2-3 пассажа их количество достигает 50-300 млн. В культуре достаточной плотности после остановки пролиферации стромальные клетки-предшественники, в отличие от фибробластов кроветворной ткани, дифференцируются в адипоциты, миоциты, клетки хряща и костной ткани. Комбинация из трех регуляторных дифференцировочных сигналов, включающая 1-метил-изобутилксантин (индуктор внутриклеточного образования цАМФ), дексаметазон (ингибитор фосфолипаз А и С) и индометацин (ингибитор циклооксигеназы, снижающий и активность тромбоксансинтазы), превращает в адипоциты до 95% прогениторных мезенхимальных клеток. Образование адипоцитов из незрелых стромальных элементов подтверждается экспрессией гена липопротеидлипазы, гистохимическим выявлением аполипопротеинов и пероксисомальных рецепторов. Клетки того же клона под влиянием TGF-b в бессывороточной среде создают гомогенную популяцию хондроцитов. Многослойная культура клеток этой хрящевой ткани характеризуется развитым межклеточным матриксом, состоящим из протеогликана и коллагена II типа. В питательной среде с 10% фетальной сывороткой воздействие комплекса сигналов дифференцировки, состоящего из b-глицерофосфата (донатор неорганического фосфата), аскорбиновой кислоты и дексаметазона, в той же культуре стромальных прогениторных клеток-предшественников приводит к формированию клеточных агрегатов. В таких клетках наблюдается прогрессирующее повышение активности щелочной фосфатазы и уровня остеопонтина, что свидетельствует об образовании костной ткани, минерализация клеток которой подтверждается прогрессивным повышением внутриклеточного содержания кальция.

По некоторым данным, способность мезенхимальных стволовых клеток к неограниченному делению и воспроизводству различных типов клеток мезенхимальной линии дифференцировки сочетается с высокой степенью пластичности. При введении в желудочки или белое вещество мозга мезенхимальные стволовые клетки мигрируют в паренхиму нервной ткани и дифференцируются в производные глиальной или нейрональной линии клеток. Кроме того, имеются сведения о трансдифференцировке МСК в стволовые гемопоэтические клетки как in vitro, так и in vivo. При более углубленном анализе в отдельных работах определена исключительно высокая пластичность МСК, что проявляется в их способности дифференцироваться в астроциты, олигодендроциты, нейроны, кардиомиоциты, гладкомышечные клетки и клетки скелетной мускулатуры. В целом ряде работ по изучению трансдифференцировочного потенциала МСК in vitro и in vivo установлено, что мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники костномозгового происхождения терминально дифференцируются в клеточные линии, формирующие костную, хрящевую, мышечную, нервную и жировую ткань, а также сухожилия и строму, поддерживающую гемопоэз.

Однако в других исследованиях никаких признаков рестрикции плюрипотентности генома мезенхимальных стволовых клеток и прогениторных популяций стромальных клеток выявить не удалось, хотя для проверки возможной плюрипотентности стромальных клеток исследовалось более 200 клонов МСК, изолированных из одной первичной культуры. Подавляющее большинство клонов in vitro сохраняли способность дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях. При исключении вероятности миграции клеток реципиента путем трансплантации мезенхимальных стволовых клеток под капсулу почки или в диффузионных камерах оказалось, что стромальные клетки-предшественники in situ сохраняют гетерогенный фенотип, что указывает либо на отсутствие в зоне пересадки рестрикционных факторов, либо на отсутствие плюрипотентности МСК как таковой. В то же время допускается существование редкого типа соматических плюрипотентных стволовых клеток, которые являются общими предшественниками всех стволовых клеток взрослого организма.

О мульти-, но не о плюрипотентности истинных мезенхимальных стволовых клеток, составляющих весьма малую долю клеток костного мозга и способных в определенных условиях при культивировании in vitro пролиферировать, не вступая в дифференцировку, свидетельствует их индуцированное коммитирование в клетки костной, хрящевой, жировой, мышечной ткани, а также в теноциты и элементы стромы, поддерживающие гемопоэз. Как правило, длительная экспозиция в культуральной среде с фетальной телячьей сывороткой провоцирует выход МСК в коммитированные стромальные клетки-предшественники, потомство которых претерпевает спонтанную окончательную дифференцировку. In vitro удается достигнуть направленного формирования остеобластов путем добавления в среду кондиционирования дексаметазона, ß-глицерофосфата и аскорбиновой кислоты, тогда как сочетание дифференцировочных сигналов дексаметазона и инсулина индуцирует образование адипоцитов.

Установлено, что перед выходом на этап терминальной дифференцировки МСК костного мозга при создании определенных условий культивирования первоначально дифференцируются в фибробластоподобные мезенхимальные стволовые клетки. Производные этих клеток in vivo принимают участие в формировании костей, хряща, сухожилий, жировой и мышечной ткани, а также стромы, поддерживающей гемопоэз. Многие авторы понимают под понятием "мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники" как собственно МСК, так и коммитированные стромальные клетки-предшественники костного мозга и мезенхимальных тканей. Клональный анализ мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников костномозгового происхождения показал, что чуть больше одной трети всех клонов дифференцируется в остео-, хондро- и адипоциты, тогда как клетки остальных клонов обладают лишь остеогенным потенциалом и формируют только хондро- и остеоциты. Такой клон мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников, как ВМС-9, в соответствующих условиях микроокружения дифференцируется в клетки с фенотипом и функциональными характеристиками не только остеобластов, хондроцитов и ади- поцитов, но и стромальных клеток, поддерживающих гемопоэз. Выделенный из фетального костного мозга крысы клон клеток RCJ3.1 дифференцируется в мезенхимальные клетки различных фенотипов. При комплексном воздействии аскорбиновой кислоты, b-глицерофосфата и дексаметазона из клеточных элементов этого клона сначала образуются многоядерные миоциты, а затем, последовательно, адипоциты, хондроциты и островки минерализованной костной ткани. Популяция гранулярных клеток из периоста плодов крысы соответствует некоммитированным мультипотентным мезенхимальным клеткам-предшественникам, поскольку характеризуется низкой скоростью пролиферации, не экспрессирует дифференцировочные маркеры, а в условиях культивирования дифференцируется с образованием хондро-, остео- и адипоцитов, а также гладкомышечных клеток.

Таким образом, следует признать, что вопрос о плюри- или мультипотентности генома мезенхимальных стволовых клеток остается открытым, что, соответственно, влияет и на представления о дифференцировочном потенциале стромальных клеток-предшественников, который также окончательно не установлен.

Экспериментально доказанной и важной характеристикой мезенхимальных стволовых клеток является их способность покидать тканевую нишу и циркулировать в общем кровотоке. Для активации генетической программы дифференцировки такие циркулирующие стволовые клетки должны попасть в соответствующее микроокружение. Показано, что при систематическом введении МСК в кровоток животным-реципиентам незрелые клетки имплантируются в разные органы и ткани, дифференцируясь затем в клетки крови, миоциты, адипоциты, хондроциты и фибробласты. Следовательно, в локальных тканевых зонах происходит сигнально-регуляторное взаимодействие между некоммитированными и коммитированными стромальными клетками-предшественниками, а также между ними и окружающими зрелыми клетками. Предполагается, что индукция дифференцировки осуществляется паракринными регуляторными факторами мезенхимального и немезенхимального происхождения (факторы роста, эйкозаноиды, молекулы экстрацеллюлярного матрикса), которые обеспечивают пространственные и временные связи в микроокружении мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников. Поэтому локальные повреждения мезенхимальной ткани должны приводить к формированию зон микроокружения мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников, качественно отличающихся от комплекса регуляторных сигналов интактных тканей, в которых происходят процессы физиологической, а не репаративной регенерации. Это различие крайне важно в плане специализации клеточного фенотипа в нормальном и индуцированном повреждением микроокружении.

По представлениям, именно здесь заложены механизмы принципиального различия двух известных процессов - физиологической регенерации и воспалительной пролиферации. Первый из них завершается восстановлением специализированного клеточного состава ткани и ее функции, тогда как итогом реализации процесса пролиферации является образование зрелых соединительнотканных элементов и утрата функции поврежденной тканевой зоны. Таким образом, для разработки оптимальных программ применения мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников в регенеративно-пластической медицине необходимо тщательное исследование особенностей воздействия факторов микроокружения на дифференцировку МСК.

Зависимость структуры компартмента стволовых клеток от клеточных пара- и аутокринных регуляторов, экспрессия которых модулируется внешними сигналами, уже ни у кого сомнения не вызывает. Среди функций регуляторных факторов важнейшими являются контроль асимметричного деления МСК и экспрессия генов, определяющих стадии коммитирования и число клеточных делений. Внешние сигналы, от которых зависит дальнейшее развитие МСК, обеспечиваются их микроокружением. В незрелом состоянии МСК достаточно длительно пролиферируют, сохраняя при этом способность к дифференцировке в линии адипоцитов, миофибробластов, стромы гематогенной ткани, клетки хряща и кости. Установлено, что ограниченная популяция циркулирующих в крови СБ34-негативных стромальных клеточных элементов из общего кровотока возвращается в строму костномозговой ткани, где трансформируется в линии СD34-позитивных гемопоэтических стволовых клеток. Эти наблюдения позволяют предположить, что рециркуляция прогениторных мезенхимальных клеток в кровотоке обеспечивает поддержку тканевого баланса стромальных стволовых клеток в разных органах посредством мобилизации общего пула незрелых стромальных элементов костного мозга. Дифференцировка МСК в клетки с множественными мезенхимальными фенотипами и их участие в регенерации или репарации костной, хрящевой, жировой ткани и сухожилий in vivo доказана с помощью моделей адоптивного переноса у экспериментальных животных. По данным других авторов, дистантная миграция МСК по сосудистому руслу сочетается с короткодистантным или локальным перемещением мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников в пределах ткани при репарации хряща, регенерации мышц и других восстановительных процессах.

Локальные стволовые резервы стромальной тканевой основы исполняют роль источника клеток в процессах физиологической регенерации ткани и пополняются за счет дистантного транспорта МСК по мере расходования стромально-тканевых стволовых ресурсов. Однако в условиях необходимости экстренной мобилизации репаративного клеточного потенциала, например при политравме, в процессах репаративной регенерации принимает участие весь эшелон МСК, и на периферию через общий кровоток рекрутируются мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга.

Пересадка мезенхимальных стволовых клеток

Прослеживаются определенные параллели между процессами физиологической регенерации тканей и их формированием в период внутриутробного развития. В эмбриогенезе человека и млекопитающих образование разнообразных типов специализированных клеток происходит из экто-, мезо- и эндодермального пула зародышевых листков, но при обязательном участии мезенхимы. Рыхлая клеточная сеть эмбриональной мезенхимальной ткани выполняет многочисленные регуляторные, метаболические, каркасные и морфогенетические функции. Закладка провизорных органов осуществляется только после конденсации мезенхимы за счет клоногенного роста прогениторных клеток, которые генерируют первичные морфогенетические сигналы органогенеза. Стромальные производные эмбриональной мезенхимы создают клеточный каркас провизорных органов и формируют основу будущего их энергопластического обеспечения за счет роста первичных кровеносных и лимфатических сосудов. Другими словами, стромальные элементы микроциркуляторной единицы фетальных органов возникают раньше формирования их структурно-функциональных единиц. Кроме того, активная миграция мезенхимальных клеток в период органогенеза обеспечивает пространственную ориентацию развивающихся органов за счет разметки их объемных границ посредством рестрикции гомеотических Нох-тепов. На стромальном каркасе происходит и сборка структурно-функциональных единиц паренхиматозных органов, в состав которых нередко входят морфогенетически и функционально совершенно разные клетки. Следовательно, в эмбриогенезе функции мезенхимы первичны и реализуются посредством генерации регуляторных сигналов, активирующих региональную пролиферацию и дифференцировку прогениторных эпителиальных клеток. Клетки эмбриональной мезенхимы вырабатывают такие факторы роста, как НОГ, HGF-b, CSF, для которых на паренхимальных прогениторных клетках имеются соответствующие рецепторы. В дифференцированной зрелой ткани взрослого организма стромальная сеть клеток также генерирует сигналы для поддержания жизнеспособности и пролиферации прогениторных клеток немезенхимального происхождения. Однако спектр стромальных регуляторных сигналов в постнатальном онтогенезе иной (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF и др.) и направлен на обеспечение физиологической регенерации или репарации поврежденных тканевых зон. Причем спектральные характеристики стромальных регуляторных факторов в каждом виде ткани и даже в пределах одного органа разные. В частности, кроветворение и лимфопоэз с размножением и дифференцировкой гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток происходит только в определенных органах, в границах которых действует стромальное микроокружение, обеспечивающее условия для созревания кроветворных и лимфоидных клеток. Именно от регуляторных факторов микроокружения зависит способность кроветворных и лимфоидных клеток репопулировать данный орган, пролиферировать и созревать в его микроструктурных нишах.

Среди компонентов экстрацеллюлярного матрикса, которые продуцируют мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники, следует отметить фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны, а также CD44 (рецептор гиалуронана и остеопонтина), принимающие основное участие в организации межклеточного взаимодействия и формировании внеклеточного матрикса в костном мозге и костной ткани. Доказано, что костномозговые мультипотентные мезенхимальные клетки-редшественники создают стромальное микроокружение, обеспечивающее индуктивными и регуляторными сигналами не только МСК, но и гемопоэтические предшественники и другие немезенхимальные стволовые клетки костного мозга. Известно, что участие МСК в кроветворении определяется их способностью дифференцироваться в стромальные клетки, поддерживающие гемопоэз, причем данный инструктивный сигнал МСК получают непосредственно от гемопоэтических стволовых клеток. Именно поэтому в культуре сеть стромальных прогениторных клеток служит фидерной основой для развития всех клонов гемопоэтических клеток.

В зрелом организме интенсивность гемо- и лимфопоэза пребывает в состоянии динамического равновесия с "расходованием" зрелых клеток крови и клеток иммунной системы на периферии. Поскольку стромальные клетки костного мозга и лимфоидных органов обновляются крайне редко, значительной перестройки стромальных структур в них не происходит. Вывести систему из динамического равновесия можно с помощью механического повреждения любого из органов гемо- или лимфопоэза, что приводит к однотипным последовательным изменениям, которые касаются не только и не столько кроветворных или лимфоидных элементов, сколько стромальных структур поврежденного органа. В процессе репаративной регенерации в первую очередь формируется стромальная основа, которая затем репопулируется кроветворными или иммунокомпетентными клетками. Этот давно известный факт делает посттравматическую регенерацию удобной моделью для изучения стромального микроокружения кроветворных органов. В частности, для исследования репаративной регенерации костного мозга используется механическое опустошение медуллярной полости трубчатых костей - кюретаж, позволяющий быстро и эффективно вывести кроветворную ткань из состояния динамического равновесия. При изучении процессов репаративной регенерации кроветворного и стромального компонентов костного мозга после механического опустошения медуллярной полости большеберцовой кости морских свинок установлено, что между показателями регенерации кроветворных и стромальных клеток (численность кроветворных клеток, концентрация и количество стромальных клеток-предшественников) нет прямой корреляции. Кроме того, оказалось, что увеличение популяции стромальных клеток-предшественников происходит в более ранние сроки после кюретажа, а сами стромальные фибробласты становятся фосфатазоположительными, что характерно для остеогенной ткани. Установлено также, что кюретаж 3-5 трубчатых костей приводит к росту этой популяции клеток в костном мозге неоперированных костей и даже в селезенке, которая у морских свинок является исключительно лимфопоэтическим органом.

Морфологическая картина репаративных процессов в костном мозге кюретированных большеберцовых костей морских свинок в целом соответствует описанным в литературе данным, полученным в ходе экспериментов на животных других видов, причем динамика изменений, происходящих после удаления кроветворной ткани, одинакова для всех видов животных и различие касается только временных параметров. Морфологически фазовый порядок восстановления кроветворения в опустошенной медуллярной полости заключается в последовательных процессах организации кровяного сгустка, образования грубоволокнистой костной ткани, ее резорбции, развития синусоидов и формирования ретикулярной стромы, которая в дальнейшем репопулируется кроветворными элементами. При этом количество прогениторных кроветворных клеток в процессе регенерации костномозговой ткани увеличивается параллельно повышению содержания стволовых гемопоэтических клеток.

Ю. Герасимов и соавторы (2001) сравнили изменения числа кроветворных клеток и количества стромальных клеток-предшественников в отдельные фазы регенерационного процесса. Оказалось, что количественные изменения костномозговых клеток в кюретированной кости соответствует динамике морфологических характеристик регенерации. Снижение в течение первых трех суток клеточного содержания в регенерате авторы связывают с гибелью кроветворных клеток вследствие неблагоприятного воздействия микроокружения, которое создает разрастающаяся ретикулярная ткань в сохранившемся костном мозге в области эпифиза, а также с образованием в последнем очагов остеоидной ткани и повреждением сосудов при кюретаже. На 7-12-е сутки повышение уровня ядеросодержащих клеток совпадает с появлением отдельных очагов миелоидного кроветворения в зонах пролиферации стромальных элементов. На 20-е сутки возникают значительные участки регенерировавшего костного мозга и хорошо развитые синусы, что сопровождается значительным увеличением общего числа клеток. Однако количество гемопоэтических элементов в этот период составляет 68% от контрольного уровня. Это согласуется с ранее опубликованными данными о том, что число кроветворных клеток после кюретажа достигает нормы лишь на 35-40-е сутки после операции.

В раннем посттравматическом периоде основным источником для восстановления гемопоэза служат локальные, сохранившиеся при кюретаже клеточные элементы. В более поздние сроки основным источником регенерации костномозговой кроветворной ткани являются стволовые клетки, репопулирующие свободные стромальные зоны. Что касается отдельных категорий стромальных клеток (эндотелиальных, ретикулярных и остеогенных), то источники, обеспечивающие их образование при перестройке костномозговой полости, остаются невыясненными. Результаты исследования Ю.В. Герасимова и соавторов (2001) свидетельствуют о том, что в сохранившемся после кюретажа костном мозге концентрация клеток, образующих колонии фибробластов, существенно выше, чем в нормальном костном мозге. Авторы считают, что при кюретаже происходит более интенсивное селективное вымывание кроветворных клеток по сравнению с колониеобразующими стромальными клетками, которые участвуют в формировании стромы и более прочно связаны с ее основным веществом, чем кроветворные клетки.

Динамика изменения численности клеток, образующих колонии фибробластов, коррелирует с интенсивностью процессов остеогенеза, последующей резорбциии костных трабекул и формирования ретикулярной стромы, которая заселятся кроветворными клетками. Большая часть стромальных клеток-предшественников в указанные сроки регенерации образует грубоволокнистую костную ткань и ретикулярную строму. При переломах бедренных костей в условиях пролонгированного остеосинтеза на 5-е сутки в зоне регенерации увеличивается концентрация и численность клеток, образующих колонии фибробластов, а в период интенсивного костеобразования их количество повышается в 6 раз. Известно, что костномозговые клетки, образующие колонии фибробластов, обладают остеогенными свойствами. Количество стромальных клеток-предшественников увеличивается перед заселением территории кюретированного костного мозга кроветворными клетками. Это хорошо согласуется с данными о том, что стромальные клетки обеспечивают образование гемопоэтического микроокружения. Очевидно, создание кроветворного микроокружения соответствует определенному уровню регенерации стромальной ткани, а численность кроветворных клеток возрастает при расширении стромального плацдарма, пригодного для кроветворения.

Наибольший интерес представляют данные авторов о том, что сразу после кюретажа увеличивается количество стромальных клеток-предшественников в отдаленных частях скелета. Начиная с шестого часа и по двадцатые сутки включительно в контрлатеральной большеберцовой кости наблюдается более чем двукратное повышение как концентрации, так и численности клеток, образующих колонии фибробластов. Механизм этого явления связан, вероятно, с тем, что массивная травма костного мозга приводит к образованию большого количества кровяных сгустков с одновременным разрушением значительного количества тромбоцитов и высвобождением в кровь тромбоцитарного фактора роста (РБСК), который, как известно, вызывает пролиферацию клеток, образующих колонии фибробластов, находящихся в организме вне пролиферативного пула. В экспериментах на кроликах локальное введение МСК способствует восстановлению хрящевой ткани хирургически поврежденного коленного сустава, что можно связать с образованием хондроцитов, происходящих из введенных МСК. Однако репаративная регенерация костных дефектов у лабораторных крыс значительно усиливается и при использовании мезенхимальных стволовых клеток, заключенных в керамический каркас. Следовательно, можно предположить, что если не РБОК, то какой-либо иной фактор, происходящий из поврежденных стромальных клеток, оказывает дистантное стимулирующее влияние на пролиферацию мезенхимальных клеток-предшественников в интактных зонах костного мозга и стимулирует их миграцию в область дефекта костномозговой ткани. В свою очередь, этому противоречат данные литературы прошлых лет, указывающие на то, что стромальные клетки, ответственные за микроокружение, в отличие от кроветворных клеток, не способны к миграции и происходят из локальных источников.

Тем не менее, результаты исследования Ю. Герасимова и соавторов (2001) свидетельствуют о том, что нанесение механической травмы вызывает не только резкую перестройку стромальной ткани в кюретированной кости, но и существенные изменения стромы в отдаленных интактных костях, то есть, имеет место системный ответ стромальной ткани на локальную травму. Причем при нанесении политравмы - множественном кюретаже - эта реакция усиливается и наблюдается не только в оперированной кости и отдаленных частях скелета, но и в лимфоидных органах, в частности в селезенке. Механизм такого системного ответа стромальной ткани костного мозга и селезенки на локальную травму и политравму остается неизвестным. Допускается, что этот процесс связан с действием гуморального фактора, выделяемого мезенхимальной стромой медуллярной полости костного мозга. О возможности выработки стромальными клетками костного мозга и селезенки органонеспецифического гуморального фактора, ответственного за пролиферацию клеток, образующих колонии фибробластов, свидетельствуют данные об их колониестимулирующей активности в монослойных культурах костного мозга.

В связи с этим стоит отметить, что при системном введении мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников их производные репопулируют не только костный мозг, но и другие ткани, что используется, в частности, для генотерапии. Показано, что при внутривенном введении больших количеств МСК с геномом дикого типа мышам с мутацией гена коллагена I донорские клетки замещают до 30% клеток в костной и хрящевой ткани реципиентов, а трансфецированные мезенхимальные стволовые клетки мыши, секретирующие IL-3 человека, в течение 9 месяцев эффективно поддерживают гемопоэз в случае их одновременного введения с гемопоэтическими стволовыми клетками человека иммунодефицитным мышам.

Генетическая модификация мезенхимальных стволовых клеток

Среди успехов экспериментальной генетической модификации МСК следует отметить трансфекцию гена фактора IX в МСК человека с последующим переносом клеток-трансфектантов иммунодефицитным мышам, что приводит к появлению в крови антигемофильного фактора В на протяжении 8 недель после трансплантации. В данном эксперименте в трансфицированных клетках осуществлялась посттрансляционная модификация фактора IX у-глутамилкарбоксилазой. Трансдукция МСК ретровирусным вектором, кодирующим фактор IX человека, оказалась менее успешной - последующее введение этих клеток собаке с гемофилией В обеспечивало терапевтический уровень фактора IX, поддерживающий нормальную интенсивность коагуляционного гемостаза, всего лишь на протяжении 12 дней.

Пересадки мезенхимальных стволовых клеток в паренхиму мозга животных показали, что донорские незрелые клетки трансформируются как в популяции нейронов, так и глии. Приживление нейрональных производных здоровой донорской мезенхимальной ткани теоретически делает возможной коррекцию генетических аномалий метаболизма мозга у пациентов с болезнью Гоше и другими нарушениями обмена липидов, ганглиозидов или углеводов.

Продолжается экспериментальный поиск условий трансдифференцировки стволовых клеток стромы костного мозга в клетки-предшественники нервной и печеночной ткани. Внимание исследователей сосредоточено на комбинациях индукторов дифференцировки и специальных кондиционных средах. В частности, для выделения первичной культуры стромальных клеток отмытые и ресуспендированные в культуральной среде DMEM/F12 (1/1) с 10% фетальной телячьей сывороткой клетки костного мозга высеваются с плотностью 200 000/см2. Через 24 часа неадгезивные клетки удаляются, а прикрепленные к пластику фибробластоподобные клетки культивируются в течение одной недели. Для дифференцировки клеток стромы костного мозга в нейробласты используется кондиционная среда, полученная путем трехсуточного культивирования первичной культуры эмбриональных фибробластов мыши, а также среда DМЕМ/F12 (1/1) с 2% фетальной телячьей сывороткой и добавлением 20 нг/мл ЫР или 10-6М ретиноевой кислоты (нейроиндукторы, которые применяются для нейральной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши и человека). Дифференцировку клеток стромы костного мозга в клетки-предшественники гепатоцитов индуцируют в кондиционной среде, созданной в результате трехсуточного культивирования первичной культуры эмбриональных клеток печени мыши в среде DМЕМ/F12 (1/1) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки.

Тут следует еще раз отметить, что колониеобразующие клетки стромы костного мозга гетероморфны и могут быть разделены на два типа. К первому типу относятся фибробластоподобные, образующие филоподии клетки с крупными ядрами и одним-двумя ядрышками. Второй тип представлен мелкими клетками веретенообразной формы. При культивировании клеток обоих типов в кондиционной среде, полученной на фидерном слое первичных эмбриональных фибробластов мыши, на З-и-4-е сутки в культуре появляются клетки, похожие на нейробласты. На этой стадии они чаще всего имеют веретенообразную форму с одним или двумя длинными отростками, заканчивающимися филоподиями. Реже встречаются пирамидные или звездчатые клетки с короткими дендритами. Дендриты одних нейробластов имеют характерные расширения (почки роста) и разветвления в своей дистальной части, других - отчетливые конусы роста с филоподиями, с помощью которых происходит рост дендритов. Аналогичные морфологические признаки (почки и конусы роста с филоподиями), присущие нейробластам, дифференцирующимся в нейроны, подробно описаны в работах по нейрогенезу. На этом основании некоторые авторы делают вывод, что обнаруживаемые ими в культуре клетки являются нейробластами. В частности, Е. Щегелъская и соавторы (2002) после культивирования первичной культуры стромальных клеток в течение двух недель в сменяемой на каждые З-и-4-е сутки кондиционной среде установили, что часть клеток пролиферирует, сохраняя недифференцированное состояние. Внешне такие клетки были похожи на фибробласты и выявлялись в культуре наряду с дифференцирующимися нейробластами. Большая же часть клеток (около 80%) находилась на разных стадиях дифференцировки в клетки нервной ткани, преимущественно в нейроны. Дендритные отростки этих клеток тесно контактировали между собой, так что постепенно клетки формировали на субстрате участки нервной сети в виде длинных многоклеточных тяжей. Дендритные отростки нейробластов становились значительно длиннее, некоторые из них в 8-10 раз превышали длину тела самого нейрона. Постепенно увеличивалась доля пирамидных и звездчатых клеток. Дендриты звездчатых клеток разветвлялись. По мнению авторов, более поздняя дифференцировка пирамидных и звездчатых клеток по сравнению с веретенообразными соответствует последовательности этапов нормального нейрогенеза у животных. В результате авторы заключают, что стволовые клетки стромы костного мозга подвергаются индуцированному нейрогенезу, в процессе которого in vitro из нейробластов образуются все три основных типа нейронов. Предшественники нервных клеток были обнаружены и во время культивирования клеток стромы костного мозга в течение 3-4 суток в среде с 2% фетальной сывороткой и 20 нг/мл LIF. Но в этом случае стволовые клетки делились очень медленно, дифференцировка нейробластов происходила только в 30% случаев и они не образовывали нейрональные сети. Используя в качестве одного из индукторов дифференцировки нервных клеток ретиноевую кислоту, авторы получили в культуре до 25-30% нервных клеток с преобладанием глиальных элементов - астроцитов и олигодендроцитов. Нейроны составляли лишь третью часть от всех нервных клеток, хотя и были представлены всеми тремя типами: веретенообразными, пирамидными и звездчатыми клетками. На 6-е сутки культивирования клеток стромы в среде с ретиноевой кислотой нервные клетки становились более дифференцированными, а у отдельных пирамидных нейронов были обнаружены аксоны, которые и в нормальном нейроонтогенезе появляются позже образования дендритных отростков. По мнению авторов, несмотря на низкий выход нервных клеток, метод индукции ретиноевой кислотой имеет свои преимущества: олигодендроциты и астроциты выполняют миелинизирующую и питающую функции во время роста дендритов и аксонов и необходимы для нормального формирования нервной ткани. Следовательно, для репарации ее поврежденных участков in vivo лучше использовать суспензию нейронов, обогащенную клетками глии.

Во второй серии опытов авторы попытались индуцировать дифференцировку клеток стромы костного мозга в клетки печени. После трехсуточного культивирования костномозговых стромальных стволовых клеток в кондиционной среде, полученной при инкубации эмбриональных гепатоцитов мыши, были обнаружены крупные, шарообразной формы клетки, часто двухядерные, с цитоплазматическими включениями разного размера. Эти клетки находились на разных стадиях дифференцировки и различались между собой по размеру, числу ядер и включений в цитоплазме. В большинстве таких клеток был выявлен гликоген, на основании чего авторы идентифицировали их как клетки-предшественники гепатоцитов. Поскольку в культуре не были обнаружены клетки, похожие на нейробласты, последовал вывод, что в кондиционной среде, полученной в результате культивирования эмбриональных гепатоцитов, отсутствуют факторы дифференцировки нервных клеток и, наоборот, присутствуют факторы, индуцирующие дифференцировку клеток стромы костного мозга в клетки-предшественники гепатоцитов. В заключение авторы предполагают наличие плюрипотентности у клеток стромы костного мозга, поскольку они дифференцируются in vitro в клетки нервной или печеночной ткани в зависимости от используемых специфических кондиционных сред и индукторов.

В некоторых работах действительно корректно показана дифференцировка клеток стромы костного мозга в кардиомиоциты, клетки хрящевой, костной и нервной ткани. Появляются сведения о том, что среди клеток костного мозга есть популяции стволовых клеток, способных дифференцироваться в гепатоциты. В свете этих данных результаты представленных выше экспериментов на мышах все же можно считать еще одним подтверждением наличия в костном мозге плюрипотентных мезенхимальных стволовых клеток, обладающих способностью дифференцироваться в клетки разных тканей взрослого организма.

Использование мезенхимальных стволовых клеток в медицине

В клинике использование производных мезенхимальных стволовых клеток связано, прежде всего, с восстановлением тканевых дефектов, возникающих при обширных и глубоких термических поражениях кожи. На доклиническом этапе была проведена экспериментальная оценка целесообразности применения аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток для лечения глубоких ожогов. Показано, что фибробластоподобные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга образуют в культуре монослой, что дает возможность трансплантировать их с целью оптимизации процессов регенерации глубоких ожоговых ран. Авторы отмечают, что подобным свойством обладают эмбриональные фибробласты, однако клиническое применение последних ограничено существующими этическими и юридическими проблемами. Глубокий термический ожог с повре-ждением всех слоев кожи моделировали на крысах линии Вистар. Площадь ожога составляла 18-20% от общей поверхности кожи. В первую экспериментальную группу вошли крысы с глубоким термическим ожогом и трансплантацией аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток. Вторую группу составили животные с глубоким термическим ожогом и транс-плантацией аллогенных эмбриональных фибробластов. Третья группа была представлена контрольными крысами с глубоким термическим ожогом, которым клеточную терапию не проводили. Суспензию фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток и эмбриональных фибробластов наносили на поверхность ожоговой раны с помощью пипетки в количестве 2 х 10⁴ клеток на 2-е сутки после моделирования ожога и иссечения образовавшегося некротического струпа. После трансплантации клеток ожоговую поверхность покрывали марлевой салфеткой, смоченной изотоническим раствором натрия хлорида с гентамицином. Забор клеток костного мозга для получения МСК с последующей их индукцией в линию фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток производили у взрослых крыс линии Вистар из бедренных костей. Эмбриональные фибробласты получали из легких 14-17-дневных эмбрионов. Эмбриональные фибробласты и клетки костного мозга для получения МСК предварительно культивировали в чашках Петри при температуре 37°С в С02-иикубаторе, в атмосфере с 5% СО2 при 95% влажности. Эмбриональные фибробласты культивировали в течение 4-6 суток, тогда как для образования монослоя МСК потребовалось от 14 до 17 суток. В дальнейшем МСК сохраняли методом криоконсервации как исходный материал для фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток, которые получали путем размораживания и культивирования МСК в течение 4 суток. Количество образующихся фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток более чем в 3 раза превосходило количество эмбриональных фибробластов, возникающих в течение того же периода культивирования. Для идентификации трансцлантированных клеток в ожоговых ранах на этапе культивирования их геном метили, используя вирусный шатл-вектор на основе рекомбинантного аденовируса V типа, несущего ген 1ас-2, кодирующий ß-галактозидазу E. coli. Живые клетки в различные сроки после трансплантации выявляли иммуногистохимически в криосрезах с добавлением субстрата X-Gal, дающего характерное сине-зеленое окрашивание. В результате динамической визуальной, планиметрической и гистологической оценки состояния ожоговой раны было установлено, что уже на 3-и сутки после трансплантации клеток в выделенных группах появляются существенные различия в течении раневого процесса. Особенно отчетливой эта разница становилась на 7-е сутки после трансплантации клеток. У животных первой группы, которым были трансплантированы фибробластоподобные мезенхимальные стволовые клетки, рана приобретала равномерно розовую интенсивную окраску, грануляционная ткань разрасталась по всей ее площади до уровня эпидермиса, а ожоговая поверхность значительно сокращалась в размерах. Несколько истончалась образовавшаяся на поверхности раны коллагеновая пленка, но она продолжала покрывать всю ожоговую площадь. У животных второй группы, которым были трансплантированы эмбриональные фибробласты, грануляционная ткань приподнималась до уровня эпидермиса краев раны, но лишь местами, в то же время плазморея из раны была более интенсивной, чем в 1-й группе, а первоначально образовавшаяся коллагеновая пленка практически исчезала. У животных, не получавших клеточной терапии, на 7-е сутки ожоговая рана представляла собой бледную, изрытую, некротизированную ткань, покрытую фибрином. Плазморея отмечалась по всей ожоговой поверхности. Гистологически у животных 1-й и 2-й групп отмечалось снижение клеточной инфильтрации и развитие сосудистой сети, причем эти признаки начинающегося регенераторного процесса были более выражены у крыс 1-й группы. В контрольной группе наблюдались признаки клеточной инфильтрации раны, гистологический рисунок новообразованных сосудов отсутствовал. На 15-30-е сутки наблюдения у животных 1-й группы площадь ожоговой поверхности была значительно меньше, чем у крыс остальных групп, а гранулирующая поверхность была более развитой. У животных 2-й группы площадь ожоговой поверхности также сокращалась по сравнению с размером ожоговых ран у крыс контрольной группы, что происходило за счет краевой эпителизации. В контрольной группе ожоговая поверхность местами оставалась бледной с редкими грануляциями, на ней появлялись сосудистые звездочки, имелись островки фибринозного налета, продолжалась умеренная плазморея по всей ожоговой поверхности, кое-где сохранялся трудно отделяемый струп. В целом у животных 3-й группы также уменьшались размеры раны, но края раны оставались подрытыми.

Таким образом, во время сравнительного исследования скорости заживления ран при использовании фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток и эмбриональных фибробластов, а также без применения клеточной терапии отмечено ускорение темпа заживления ожоговой поверхности в результате трансплантации фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток и эмбриональных фибробластов. Однако в случае использования аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток скорость заживления ран была выше, чем при трансплантации эмбриональных фибробластов. Это выражалось в ускорении смены фаз регенераторного процесса - сокращались сроки клеточной инфильтрации, повышался темп разрастания сосудистой сети, а также образования грануляционной ткани.

Результаты динамической планиметрии свидетельствуют о том, что скорость спонтанного заживления ожоговой раны (без применения клеточной терапии) была самой низкой. На 15-е и 30-е сутки после трансплантации аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток темп заживления ран был выше, чем при трансплантации эмбриональных фибробластов. Гистохимический метод выявления бета-галактозидазы показал, что после трансплантации фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток и эмбриональных фибробластов на протяжении всего срока наблюдения на поверхности и в глубине регенерирующих ран трансплантированные клетки остаются жизнеспособными. Авторы полагают, что более высокая скорость регенерации ожоговых ран при использовании фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток обусловлена выделением этими клетками в процессе созревания биологически активных ростостимулируюших факторов.

Трансплантация ауто- или аллогенных кератиноцитов и аллогенных фибробластов с целью лечения ожоговых ран применялась и в клинике. Надо заметить, что хирургическое лечение детей с обширными глубокими ожогами является сложнейшей задачей вследствие высокой травматичности и многократности оперативных вмешательств, значительной кровопотери, различных реакций на используемые инфузионные среды. Основные трудности в выполнении кожно-пластических операций при обширных глубоких ожогах, по площади превышающих 40% поверхности тела, обусловлены тяжестью состояния пострадавших и отсутствием донорских ресурсов кожи. Применение сетчатых трансплантатов с большим коэффициентом перфорации не решает проблемы, поскольку образующиеся после перфорации ячейки эпителизируются очень медленно, а сами кожные лоскуты нередко лизируются или высыхают. Такие покрытия ожоговых ран, как ксенокожа, трупные аллотрансплантаты, синтетические пленочные покрытия не всегда достаточно эффективны, поэтому разрабатываются новые методы закрытия ожоговых поверхностей пластами культивированных кератиноцитов и фибробластов. В частности, предложен метод закрытия ожоговых поверхностей с помощью культивированных аллофибробластов, оказывающих при пересадке выраженное стимулирующее влияние на пролиферацию эпидермоцитов, сохранившихся в ране при пограничных ожогах, а также кератиноцитов в перемычках сетчатых трансплантатов. В работе Л. Будкевича и соавторов (2000) приведены результаты применения этого метода для лечения ожогов у детей. Под наблюдением находился 31 ребенок с термической травмой в возрасте от 1 года до 14 лет. У троих детей общая площадь ожоговых ран IIIА-В - IV степени составила 40%, у 25 - 50-70%, еще у троих - 71-85% поверхности тела. Раннюю хирургическую некрэктомию сочетали с трансплантацией культивированных аллофибробластов и аутодермопластикой. На первом этапе лечения проводилось иссечение некротических тканей, на втором - трансплантация культивированных аллофибробластов на пленках-носителях, на третьем (через 48 часов после трансплантации культивированных аллофибробластов) - удаление матрикса и аутодермопластика кожными лоскутами с коэффициентом перфорации 1:4. Трем пациентам, поступившим в клинику с тяжелой ожоговой болезнью, культивированные аллофибробласты были пересажены на гранулирующие раны. Трансплантацию культивированных аллофибробластов осуществляли однократно у 18 детей, дважды - у 11, трижды - у двух пациентов. Площадь раневой поверхности, закрываемой клеточной культурой, составила от 30 до 3500 см2. Эффективность применения культивированных аллофибробластов оценивали по общему проценту приживления кожных лоскутов, срокам заживления ожогов и числу летальных исходов тяжелой термической травмы. Приживление трансплантатов было полным у 86% больных. Частичное неприживление кожных лоскутов отмечено в 14% случаев. Несмотря на проводимое лечение, шестеро (19,3%) детей умерли. Общая площадь поражения кожи у них составила от 40 до 70% поверхности тела. Трансплантация культивированных аллофибробластов не имела отношения к летальному исходу ожоговой травмы ни у одного больного.

Анализируя результаты лечения, авторы отмечают, что ранее к ожогам, несовместимым с жизнью, относили глубокое термическое поражение кожи площадью 35-40% поверхности тела (для детей младшего возраста - до 3 лет - критическими являются глубокие ожоги с площадью 30%, для детей старшего возраста - свыше 40% поверхности тела). При выполнении хирургической некрэктомии с трансплантацией культивированных аллофибробластов и последующей аутодермопластикой кожными лоскутами с большим коэффициентом перфорации ожоги IIIB - IV степени остаются критическими, но в настоящее время появляются перспективы во многих случаях сохранить жизнь даже таким пострадавшим. Хирургическая некрэктомия в сочетании с трансплантацией культивированных аллофибробластов и аутодермопластикой у детей с глубокими ожогами оказалась особенно эффективной у пациентов с распространенными поражениями кожного покрова при дефиците донорских участков. Активная хирургическая тактика и пересадка культивированных аллофибробластов способствуют быстрой стабилизации общего состояния таких пациентов, уменьшению числа инфекционных осложнений ожоговой болезни, созданию благоприятных условий для приживления трансплантатов, сокращению сроков восстановления утраченного кожного покрова и длительности стационарного лечения, снижению частоты летальных исходов у пострадавших с обширными ожогами. Таким образом, трансплантация культивированных аллофибробластов с последующей аутодермопластикой кожными лоскутами позволяет добиться выздоровления у детей с тяжелыми ожогами, которые ранее считались обреченными.

Общепризнано, что первоочередной задачей лечения ожоговой болезни является максимально полное и быстрое восстановление поврежденного кожного покрова для предупреждения возникающих при этом токсических влияний, инфекционных осложнений и обезвоживания организма. Результаты применения культивированных клеток в значительной степени зависят от подготовленности к трансплантации самой ожоговой раны. В случаях трансплантации культивированных кератиноцитов на раневую поверхность после хирургической некрэктомии приживляется в среднем 55% (по площади) пересаженных клеток, тогда как при гранулирующих ранах частота приживления снижается до 15%. Поэтому успешное лечение обширных глубоких ожогов кожи требует, в первую очередь, активной хирургической тактики. При наличии ожоговых ран IIIB-IV степени ожоговую поверхность немедленно освобождают от некротизированных тканей с целью уменьшения явлений интоксикации и снижения количества осложнений ожоговой болезни. Применение такой тактики является залогом сокращения времени с момента получения ожога до закрытия ран и сроков пребывания больных с обширными ожогами в стационаре, а также существенно уменьшает число летальных исходов.

Первые сообщения об успешном использовании культивированных кератиноцитов с целью покрытия ожоговой поверхности появились в начале восьмидесятых годов прошлого века. В последующем эту манипуляцию осуществляли с помощью пластов культивированных кератиноцитов, полученных чаще всего из аутоклеток, значительно реже - из аллокератиноцитов. Однако технология аутокератиноцитопластики не позволяет создать банк клеток, в то время как сроки, необходимые для изготовления достаточного по площади трансплантата из кератиноцитов, велики и составляют 3-4 недели. За этот период резко возрастает риск развития инфекционных и других осложнений ожоговой болезни, что значительно продлевает общее время пребывания пациентов в стационаре. Кроме того, аутокератиноциты практически не приживляются при трансплантации на гранулирующие ожоговые раны, а высокая стоимость специальных ростовых сред и биологически активных стимуляторов роста кератиноцитов значительно ограничивает их клиническое применение. Другие биотехнологические методы, такие как коллагенопластика, трансплантация криоконсервированной ксенокожи, а также использование различных биополимерных покрытий повышают эффективность лечения обширных поверхностных, но не глубоких ожогов. Метод покрытия раневой поверхности с помощью культивированных фибробластов принципиально отличается тем, что в качестве основного компонента культивированного пласта клеток используются не кератиноциты, а фибробласты.

Предпосылкой для разработки метода послужили данные о том, что перициты, окружающие мелкие сосуды, являются про- гениторными мезенхимальными клетками, способными трансформироваться в фибробласты, которые продуцируют многие факторы роста и обеспечивают заживление раны за счет сильного стимулирующего воздействия на пролиферацию и адгезию кератиноцитов. Использование культивированных фибробластов для закрытия раневых поверхностей сразу же выявило ряд существенных преимуществ этого метода по сравнению с применением культивированных кератиноцитов. В частности, получение фибробластов в культуре не требует использования специальных питательных сред и стимуляторов роста, что снижает стоимость трансплантата более чем в 10 раз относительно стоимости получения кератиноцитов. Фибробласты легко подвергаются пассированию, в процессе которого они частично утрачивают поверхностные антигены гистосовместимости, что, в свою очередь, открывает возможность использования для изготовления трансплантатов аллогенных клеток и создания их банков. Сокращаются сроки получения трансплантатов, готовых к применению в клинике, с 3 недель (для кератиноцитов) до 1-2 дней (для фибробластов). Первичную культуру фибробластов можно получить методом культивирования из клеток фрагментов кожи, взятых при аутодермопластике, а плотность посева клеток при получении субкультур фибробластов человека составляет всего 20 х 10³на 1 см².

С целью изучения влияния фибробластов и их регуляторных белков на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов проведен сравнительный анализ особенностей морфологии и пролиферации кератиноцитов на субстратах из коллагена I и III типов, а также фибронектина в совместной культуре с фибробластами человека. Кератиноциты человека выделяли из фрагментов кожи больных с ожогами, взятой во время операции аутодермопластики. Плотность посева кератиноцитов составляла 50 х 103 клеток на 1 см2. Клиническая эффективность трансплантации культивируемых фибробластов оценивалась у 517 больных. Все пациенты были разделены на две группы: 1-я - взрослые пострадавшие с ожогами IIA,В - IV степени; 2-я - дети с глубокими ожогами IIIB - IV степени. Оценка динамики структурно-функциональной организации фибробластов монослойной культуры с учетом роли в процессах регенерации гликозаминогликанов, фибронектина и коллагена позволила авторам определить 3-и сутки как наиболее благоприятный срок использования культур фибробластов для изготовления трансплантатов. Исследование влияния фибробластов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов показало, что в условиях in vitro фибробласты оказывают выраженное стимулирующее воздействие, в первую очередь, на процессы адгезии кератиноцитов, увеличивая число прикрепившихся клеток и скорость их фиксации более чем в 2 раза. Стимуляция процессов адгезии сопровождается повышением интенсивности синтеза ДНК и уровня пролиферации кератиноцитов. Кроме того, оказалось, что присутствие фибробластов и сформированного ими экстрацеллюлярного матрикса является необходимым условием для формирования тонофибриллярного аппарата кератиноцитов, межклеточных связей и, в конечном счете, для дифференцировки кератиноцитов и образования базальной мембраны. При лечении детей с глубокими ожогами установлена высокая клиническая эффективность трансплантации культуры аллофибробластов, особенно в группе пациентов с обширными поражениями кожного покрова в условиях дефицита донорских участков. Комплексное морфофункциональное исследование показало, что фибробласты трансплантата характеризуются активным синтезом ДНК, а также коллагена, фибронектина и гликозаминогликанов, которые входят в состав формируемого клетками экстрацеллюлярного матрикса. Авторы указывают на высокий процент приживления трансплантированных фибробластов (до 96%), резкое сокращение сроков их получения (в течение 24-48 часов вместо 2-3 недель в случае использования кератиноцитов), существенное ускорение эпителизации ожоговой поверхности, а также значительное удешевление (в 10 раз) технологии выращивания трансплантата из фибробластов по сравнению с трансплантацией кератиноцитов. Применение трансплантации культивируемых аллофибробластов дает возможность спасать жизнь детей с критическими ожогами - термическим поражением более 50% поверхности тела, что ранее считалось несовместимым с жизнью. Надо отметить, что при трансплантации аллогенных эмбриональных фибробластов также убедительно доказаны не только более быстрая регенерация раны и реконвалесценция больных с различной степенью и площадью ожога, но и существенное снижение их смертности.

Аутологичные фибробласты применяют и в такой сложнейшей области пластической хирургии, как восстановительная коррекция повреждений голосовых связок. Обычно с этой целью используется бычий коллаген, длительность действия которого ограничена его иммуногенностью. Являясь чужеродным белком, бычий коллаген чувствителен к коллагеназе реципиента и может вызывать иммунные реакции, для снижения риска которых были разработаны технологии получения препаратов коллагена, перекрестно связанного с глутаральдегидом. Их преимущество заключается в большей стабильности и меньшей иммуногенности, что нашло практическое применение в устранении дефектов и атрофии голосовых связок. Инъекции аутологичного коллагена впервые были использованы в 1995 году. Методика обеспечивала сохранение первичной структуры волокон аутологичного коллагена, включая внутримолекулярные энзиматически катализированные перекрестные связи. Дело в том, что натуральные коллагеновые волокна более устойчивы к разрушению протеазами, чем реконституированный коллаген, в котором телопептиды разрезаны. Целостность телопептидов важна для четвертичного строения коллагеновых волокон и образования перекрестных связей между смежными молекулами коллагена. В отличие от препаратов бычьего коллагена, аутологичный коллаген не вызывает у реципиента иммунных реакций, однако он недостаточно эффективен в качестве восполняющего агента. Стойкая коррекция может быть достигнута за счет локальной продукции коллагена путем трансплантации аутологичных фибробластов. Однако при исследовании эффективности пересадки аутологичных фибробластов в клинике выявились определенные затруднения. В раннем периоде после трансплантации фибробластов клинический эффект оказался слабее по сравнению с таковым после введения бычьего коллагена. При культивировании аутологичных фибробластов не исключена возможность трансформации нормальных фибробластов в патологические, так называемые миофибробласты, ответственные за развитие фиброза и образование рубцов, о чем свидетельствует сокращение коллагенового геля, обусловленное специфическим взаимодействием фибробластов и коллагеновых фибрилл. Кроме того, после серийного пассирования in vitro фибробласты теряют способность синтезировать белки внеклеточного матрикса.

Тем не менее, в настоящее время экспериментально отработана методика культивирования аутологичных фибробластов человека, устраняющая указанные выше недостатки и не приводящая к онкогенной трансформации нормальных фибробластов. Полученные по такой методике аутологичные фибробласты используются для восполнения дефектов мягких тканей лица. В исследовании Г. Келлер и соавторов (2000) лечение получали 20 пациентов в возрасте от 37 лет до 61 года с морщинами и атрофическими рубцами. Биоптаты кожи (4 мм) заушной области транспортировали в лабораторию в стерильных пробирках, содержащих 10 мл культуральной среды (среда Игла с антибиотиком, микосептиком, пируватом и эмбриональной телячьей сывороткой). Материал помещали внутрь 3-5 культуральных чашек диаметром 60 мм и инкубировали в термостате с атмосферой, содержащей 5% С02. Через 1 неделю клетки снимали с чашек путем трипсинизации и помещали во флаконы площадью 25 см2. Клетки вводили пациентам в количестве 4 х 107. Значительный и стойкий клинический эффект наблюдался у пациентов при коррекции носогубных складок, а также у пациентов с рубцами через 7 и 12 месяцев после третьей трансплантации аутологичных фибробластов. По данным проточной цитометрии, культивированные фибробласты продуцировали большое количество коллагена I типа. В исследованиях in vitro показана нормальная сократительная способность инъецируемых фибробластов. Через 2 месяца после подкожного введения культивированных фибробластов в дозе 4 х 107 клеток у мышей nude опухолей выявлено не было. Инъецируемые фибробласты не вызывали у пациентов образования рубцов и диффузного фиброза. По мнению автора, приживленные аутологичные фибробласты способны постоянно продуцировать коллаген, что даст косметический эффект омоложения. При этом, поскольку сроки жизни дифференцированных клеток ограничены, фибробласты, взятые у молодого пациента, более эффективны, чем полученные у пожилых людей. В перспективе предполагается возможность криоконсервации культуры фибробластов, взятых у молодого донора, чтобы позже трансплантировать пожилому пациенту его собственные молодые клетки. В заключение следует не вполне корректный вывод о том, что аутологичные фибробласты при условии их функциональной сохранности являются идеальным средством коррекции дефектов мягких тканей лица. При этом сам же автор отмечает, что в процессе исследования возникли и некоторые проблемные ситуации, связанные с применением аутологичной фибробласт-коллагеновой системы. Клинический эффект часто оказывался слабее, чем при использовании бычьего коллагена, что вызывало разочарование пациентов.

В целом, литературные данные о перспективах клинического применения мезенхимальных стволовых клеток выглядят достаточно оптимистично. Предпринимаются попытки использования аутологичных костномозговых мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников для лечения дегенеративных поражений суставов. Проводятся первые клинические испытания применения культивируемых мезенхимальных прогениторных клеток в терапии сложных переломов кости. Ауто- и аллогенные мезенхимальные клетки стромы костного мозга используются для создания хрящевой ткани с целью трансплантации при коррекции дефектов суставного хряща вследствие травмы или аутоиммунных поражений. Отрабатываются методики клинического применения мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников для устранения костных дефектов у детей с тяжелой формой незавершенного остеогенеза, вызванной мутациями гена коллагена I типа. После миелоабеляции детям-реципиентам трансплантируется костный мозг от НLА-совместимых здоровых доноров, поскольку нефракционированный костный мозг может содержать достаточное количество мезенхимальных стволовых клеток для восполнения тяжелого костного дефекта. После трансплантации аллогенного костного мозга таким детям отмечены позитивные гистологические изменения в трабекулярных костях, увеличение скорости роста и снижение частоты костных переломов. В отдельных случаях положительный клинический результат достигается при пересадке близкородственного аллогенного костного мозга и остеобластов. Для лечения врожденной хрупкости костей, обусловленной дисбалансом остеобластов и остеокластов в костной ткани, используется и трансплантация МСК. Восстановление костеобразования в этом случае достигается за счет химеризации пула стволовых и прогениторных стромальных клеток в костной ткани пациентов.

Продолжается совершенствование методик генетической модификации донорских мезенхимальных стволовых клеток с целью коррекции генетических дефектов стромальных тканей. Предполагается, что уже в ближайшее время мезенхимальные клетки-предшественники будут использоваться в неврологии для направленной химеризации клеток мозга и создания здорового пула клеток, способного генерировать дефицитный фермент или фактор, ответственный за клинические проявления заболевания. Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток может использоваться для восстановления стромы костного мозга у онкологических больных после радио- и химиотерапии, а в сочетании с костномозговыми клетками - для восстановления гемопоэза. Развитию заместительной терапии, направленной на устранение дефектов опорно-двигательного аппарата с помощью МСК, способствуют инженерные разработки в области конструирования матричных биоматериалов или биомиметиков, формирующих каркасы, заселяемые потомством мезенхимальных стволовых клеток.

Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток

В клинической трансплантологии мезенхимальные стволовые клетки человека могут быть использованы для обеспечения экспансии гемопоэтических стволовых клеток, а также их ранних прекоммитированных потомков. В частности, введение аутологичных гемопоэтических стволовых клеток и МСК онкологическим больным после проведения высокодозовой химиотерапии ускоряет восстановление количества нейтрофилов и тромбоцитов в периферической крови. Алло- и аутогенные пересадки мезенхимальных стволовых клеток применяются для лечения множественной миеломы, апластической анемии и спонтанной тромбоцитопении - заболеваний, связанных с первичным дефектом стромы кроветворной ткани. Эффективность клеточной терапии при онкогематологической патологии во многих случаях выше при одновременном введении стромальных и гемопоэтических стволовых клеток, что проявляется сокращением послеоперационного периода восстановления кроветворения, снижением числа летальных исходов вследствие неселективного разрушения регионарных и циркулирующих раковых клеток, при котором погибают и собственные прогениторные кроветворные клетки больного. Перспективность применения МСК и других мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников в клинической практике обусловлена относительной легкостью получения их из аспиратов костного мозга, экспансии в культуре и трансфекции терапевтических генов. При этом для восполнения местных тканевых дефектов можно использовать локальную имплантацию мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников, а при системных дисфункциях тканей мезенхимального происхождения не исключается их введение в общий кровоток.

Более осторожны в своих рассуждениях авторы работ, в которых перспективы применения МСК для локальной, системной трансплантации и генной терапии анализируются с точки зрения биологии стромальных клеток. Постнатальный костный мозг традиционно рассматривается как орган, состоящий из двух основных систем четко выраженных клеточных линий - собственно гемопоэтической ткани и ассоциированной с ней поддерживающей стромы. Поэтому мезенхимальные стволовые клетки костного мозга изначально расценивали исключительно как источник стромальной основы для продукции регуляторных факторов гемопоэтической микросреды. Затем внимание исследователей переключилось на изучение роли МСК как стволового источника скелетных тканей. Новейшие данные указывают на неожиданный потенциал дифференциации стромальных клеток костного мозга с образованием нейральной или мышечной ткани. Другими словами, мезенхимальные стволовые клетки проявляют трансгермальную пластичность - способность дифференцироваться в клеточные типы, фенотипически не связанные с клетками первоначальной ткани. При этом некоторые аспекты биологии стромальных клеток костного мозга остаются неясными и нерешенными как в общебиологическом плане, так и в отдельных деталях, включающих идентификацию, природу, происхождение, развитие и функцию in vivo стромальных клеток костного мозга, а также допустимый потенциал дифференциации ex vivo и возможности терапевтического применения in vivo. Полученные данные о потенциальных возможностях МСК, как и результаты исследований регенераторного потенциала прочих стволовых клеток, вступают в резкое противоречие с установленными в биологии догмами.

При культивировании в условиях низкой плотности стволовые стромальные клетки костного мозга образуют четкие колонии, каждая из которых является производной одной клетки-предшественника. Процент стромальных клеток-предшественников в ядросодержащих клетках костного мозга, определенный по способности образовывать колонии, значительно зависит как от условий культивирования, так и от видовой принадлежности МСК. Например, у грызунов для получения максимального количества стромальных клеток-предшественников абсолютно необходимо наличие в культуре облученных фидерных клеток костного мозга и сыворотки, тогда как у человека колониеобразующая эффективность мезенхимальных стволовых клеток не зависит ни от фидера, ни от питательной среды. Количество известных митогенных факторов, стимулирующих пролиферацию стромальных клеток-предшественников, ограничено. К таковым относятся PDGF, EGF, FGF, TGF-b, а также IGF1. При оптимальных условиях культивирования поликлональные линии МСК выдерживают in vitro более 50 клеточных делений, что дает возможность получить миллиарды стромальных клеток костного мозга из 1 мл его аспирата.

Однако популяция стромальных клеток костного мозга гетерогенна, что проявляется как вариабельностью размеров колоний, разной скоростью их образования, так и разнообразием клеточной морфологии, которая охватывает диапазон от фибробластоподобных веретенообразных до крупных плоских клеток. При развитии таких культур через 20 суток отмечается и фенотипическая гетерогенность. Часть колоний отличается высокой экспрессией щелочной фосфатазы, другие вообще ее не экспрессируют, а колонии третьего типа являются фосфатазопозитивными в центральном регионе и фосфатазонегативными на периферии. Отдельные колонии формируют узелки костной ткани (начало матричной минерализации маркируется при окрашивании ализариновым красным или на кальций по Ван-Косса). В других колониях происходит аккумуляция жира, идентифицируемая по G-окрашиванию масляным красным. Реже колонии мезенхимальных стволовых клеток образуют хрящи, окрашивающиеся альцианом голубым).

После эктопической трансплантации экспериментальным животным поликлональные линии MGK образуют эктопическую кость с сетчатообразной стромой, ассоциированной с миелопоэзом и адипоцитами, а также, но реже, с хрящевой тканью. При трансплантации моноклональных линий стромальных клеток костного мозга в некоторых случаях наблюдается химеризм, при котором образовавшаяся de novo кость состоит из клеток костной ткани, содержит строму и адипоциты донорского происхождения, тогда как клетки гемопоэтической линии и система сосудов происходят от реципиента.

Результаты этих исследований подтверждают стволовую природу стромальной клетки-предшественника костного мозга, от которой была получена клональная линия. Они же одновременно свидетельствуют о том, что не все клоногенные в культуре клетки действительно являются мультипотентными стволовыми клетками. Некоторые исследователи считают, и мы разделяем их мнение, что наиболее достоверную информацию о реальном потенциале дифференциации индивидуальных клонов можно получить только in vivo после трансплантации, а не путем определения фенотипа их производных in vitro. Экспрессия в культуре фенотипических маркеров остео-, хондро- или адипогенеза (определяемая по мРНК или с помощью гистохимической техники) и даже производство минерализированной матрицы не отражает степень плюрипотентности отдельного клона in vivo. Поэтому идентификация стволовых клеток в группе стромальных клеток возможна только а posteriori, в соответствующих условиях биологической трансплантационной пробы. В частности, хондрогенез очень редко наблюдается в открытых трансплантационных системах, тогда как образование хряща далеко не редкость в системах закрытых, таких как диффузионные камеры или в микромассных культурах стромальных клеток in vitro, где достигается локальное низкое напряжение кислорода, способствующее формированию хрящевой ткани. Следовательно, даже техника трансплантации, а также неспецифические условия культивирования in vitro существенно влияют на диапазон дифференцировки МСК.

Экспериментальная трансплантация с соблюдением заданных условий эксперимента - золотой стандарт определения потенциала дифференцировки стромальных клеток костного мозга и ключевой элемент собственно их идентификации. Исторически исследования по пересадке стромальных клеток костного мозга связаны с общей проблемой трансплантации костного мозга. При этом установлено, что гемопоэтическое микроокружение создается посредством трансплантации линий стромальных клеток костного мозга и обеспечивает эктопическое развитие гемопоэтической ткани в зоне трансплантации. Происхождение микросреды от донора, а гемопоэтической ткани - от хозяина позволяет рассматривать эктопическую кость как истинную "инвертированную" трансплантацию костного мозга. Локальная трансплантация стромальных клеток костного мозга способствует эффективной коррекции костных дефектов, более выраженной, чем при спонтанной репаративной регенерации. В нескольких доклинических исследованиях на экспериментальных моделях убедительно доказана возможность применения трансплантатов стромальных клеток костного мозга в ортопедии, хотя для оптимизации этих методик, даже в простейших случаях, необходима самая тщательная работа и анализ. В частности, оптимальные условия экспансии остеогенных стромальных клеток ex vivo еще не установлены, не отработанными остаются структура и состав идеального носителя, а также количество клеток, необходимых для объемной регенерации кости.

Помимо применения размноженных ex vivo стромальных клеток костного мозга с целью регенерации тканей мезенхимального происхождения неортодоксальная пластичность МСК открывает потенциальные возможности их использования для регенерации нейральных клеток или доставки генных продуктов в ЦНС. В принципе, это упрощает клеточную терапию при поражении нервной системы, поскольку отпадает необходимость получения аутогенных нейральных стволовых клеток человека. Сообщается о возможностях использования клеток костного мозга для генерации кардиомиоцитов и миогенных клеток-предшественников как истинно стромального, так внестромального происхождения.

Проводятся эксперименты по системной трансплантации стромальных клеток костного мозга для лечения общих заболеваний скелета. Нет сомнений, что стромальные клетки костного мозга представляют собой популяцию, отвечающую за генетические нарушения при заболеваниях скелета, что хорошо иллюстрируется векторным переносом с помощью этих клеток генетической информации, которая приводит к образованию патологической костной ткани у экспериментальных животных. Однако способность стромальных клеток имплантироваться, приживляться, размножаться и дифференцироваться в костях скелета после введения в общий кровоток до сих пор не доказана.

Отчасти это связано с тем, что в стандартной процедуре пересадки костного мозга строма не трансплантируется вместе с гемопоэтической тканью, поэтому строгие критерии оценки успешного приживления системно вводимых стромальных клеток еще только предстоит разработать. При этом следует помнить, что наличие маркерных генов в тканевых экстрактах или выделение в культуре клеток донорского происхождения свидетельствует не о приживлении клеток, а лишь об их выживании. Даже внутриартериальное введение стромальных клеток костного мозга в конечность мыши может привести к фактически нулевому результату приживления, несмотря на то что клетки донорского происхождения обнаруживаются в большом количестве внутри микрососудистой сети костного мозга. К сожалению, такие клетки обычно описываются как "приживленные" всего лишь на основании результатов определения маркерных донорских генов в условиях культуры ex vivo. Кроме того, необходимо предоставлять убедительные доказательства длительной интеграции в исследуемых тканях дифференцированных и функционально активных клеток донорского происхождения. Во многих опубликованных работах, где сообщается о приживлении стромальных клеток костного мозга в скелете, бросается в глаза именно отсутствие четких данных такого рода. Тем не менее, надо отметить, что в некоторых корректных экспериментах на животных действительно установлено хотя и ограниченное, но реальное приживление стромальных клеток- предшественников после их системного введения.

Эти данные согласуются с результатами изучения возможности доставки миогенных клеток-предшественников костного мозга в мышцы через сосудргстую систему. Однако не следует забывать, что и скелетная, и мышечная ткань образуется в ходе развития и роста на основе экстраваскулярных перемещений клеток, которые используют миграционные процессы, не предусматривающие циркуляцию в крови. Если и в самом деле существует независимый циркуляторный путь для доставки клеток-предшествённршов в солидные фазовые ткани, то можно ли допустить и существование физиологически циркулирующих мезенхимальных клеток-предшественников? Каково происхождение этих клеток как в развивающемся, так и в постнатальном организме, и как они проникают через сосудистую стенку? Решение этих вопросов представляется абсолютно необходимым и требует самого тщательного доклинического анализа. Даже после того как будут найдены ответы на эти вопросы, нерешенными останутся проблемные кинетические аспекты, связанные со скелетным ростом и ремоделированием соединительной ткани. В то же время лечение нарушений остеогенеза посредством замены всей популяции мутированных скелетных клеток-предшественников на здоровые стромальные элементы представляется реальной клинической перспективой. При этом локальные зоны перелома или деформации вследствие патологического остеогенеза, а также деструктивные изменения костной ткани можно будет корригировать с помощью культивированных in vitro стромальных стволовых клеток. Следовательно, направление будущих исследований целесообразно сфокусировать на проблемах преобразования или генетической коррекции аутологических мутированных остеогенных клеток-предшественников ex vivo.

Генная инженерия клеток, кратковременная или постоянная, стала основой клеточной и молекулярной биологии, источником многих научных открытий, касающихся роли отдельных белков в клеточном обмене веществ in vitro и in vivo. Применение молекулярных технологий с целью коррекции наследственной патологии и заболеваний человека весьма перспективно для практической медицины, поскольку свойства стромальных стволовых клеток костного мозга дают возможность разработки уникальных схем трансплантации для коррекции генетических заболеваний скелета. При этом мезенхимальные клетки- предшественники достаточно легко можно получить от будущего реципиента, они поддаются генетическому манипулированию и способны размножаться в больших количествах за короткий период времени. Использование мезенхимальных стволовых клеток позволяет избежать ограничений и риска, связанных с доставкой генетического информационного материала непосредственно к пациенту через вртрусные векторные конструкции. Подобная стратегия применима pi к эмбриональным стволовым клеткам, однако аутогенные постнатальные стромальные клетки костного мозга - более предпочтительный материал, поскольку их введение исключает возможные иммунологические посттрансплантационные осложнения. Для достижения кратковременного эффекта, например с целью ускорения регенерации костей, наиболее оптимальным методом является генетическая модификация мезенхимальных стволовых клеток с помощью электропорацрш, химического слияния, липофекции, плазмид и аденовирусных конструкций. В частности, вирусная трансфекция в стромальные клетки костного мозга ВМР-2 оказалась эффективной в плане ускорения регенерации костей при экспериментальной политравме. Создание аденовирусных векторных конструкций предпочтительней ввиду отсутствия токсичности. Однако генетическая модификация стромальных клеток костного мозга в этом случае отличается крайне низкой стабильностью. Кроме того, нормальные трансформированные стромальные клетки костного мозга требуют применения векторных носителей генетической информации в 10 раз более инфективных, чем другие клеточные типы, что значительно увеличивает процент гибели трансфицируемых клеток.

Для лечения рецессивных заболеваний, обусловленных низкой или нулевой биологической активностью определенных генов, необходима длительная или перманентная модификация мезенхимальных стволовых клеток, что требует использования адено-ассоциированных вирусов, ретровирусов, лентивирусов или адено-ретровирусных химер. Транспортные участки этих вирусов способны переносить крупные трансфекты ДНК (до 8 кб). В научной литературе уже появились сведения об экзогенной биологической активности стромальных клеток костного мозга, трансфицированных ретровирусными конструкциями, кодирующими синтез регуляторных и маркерных молекул - IL-3, CD2, фактора VIII, а также ферментов, принимающих участие в синтезе L-DOPA. Но и в этих работах авторы указывают на ряд ограничений, которые необходимо преодолеть до начала практического применения данной технологии. Первая проблема состоит в оптимизации процесса модификации MCK ex vivo. Известно, что длительная (3-4 недели) пролиферация стромальных клеток костного мозга in vitro снижает их трансфицируемость. В то же время для достижения высокого уровня генетической модификации МСК необходимо проведение нескольких циклов трансфицировадия. Вторая проблема связана с длительностью экспрессии терапевтического гена, которая пока еще не превышает четырех месяцев. Закономерное снижение эффективной генной экспрессии обусловлено инактивацией промоторов и гибелью модифицированных клеток. При общей перспективности переноса генетической информации с помощью мезенхимальных стволовых клеток результаты предварительных исследований свидетельствуют о необходимости дальнейшей оптимизации методов трансфекции ex vivo, выбора адекватного промотора, регулирующего биологическую активность в нужном направлении, и повышения способности модифицированных стромальных клеток костного мозга к самоподдержанию in vivo после трансплантации. Следует отметить, что использование ретровирусных конструкций для модификации стромальных клеток костного мозга в нужном направлении не всегда требует их обязательного приживления. Трансфицированные мезенхимальные стволовые клетки могут выполнять корригирующую функцию на фоне стабильной резидентности и без обязательного активного физического инкорпорирования и функционирования в соединительной ткани. В этом случае их следует рассматривать как биологический мини-насос, продуцирующий in vivo фактор, дефицит которого определяет манифестацию генетической патологии.

Использование преобразованных стромальных клеток костного мозга для лечения доминантной генетической патологии, которая характеризуется экспрессией гена с патологической или ненормальной биологической активностью, является гораздо более проблематичным, поскольку в этом случае необходимо блокировать передачу или реализацию искаженной генетической информации. Один из методов генной инженерии - гомологичное рекомбинирование эмбриональных стволовых клеток с целью создания трансгенных животных. Однако крайне низкая степень гомологичного рекомбинирования в сочетании с проблемами идентификации, сепарации и экспансии таких рекомбинантов вряд ли будет способствовать широкому применению данного метода в ближайшем будущем, даже при условии разработки новых технологических приемов. Второй подход в генной терапии доминантной патологии основан на автоматической коррекции поврежденной ДНК, поскольку генетические мутации могут корригироваться путем введения экзогенной ДНК с нужной последовательностью (короткие ДНК-олигонуклеотиды или химерные РНК/ДНК-олигонуклеотиды), которая связывается с гомологами в поврежденном геноме. Третий вариант предусматривает блокировку передачи патологической информации, что достигается за счет использования специфически сконструированных олигонуклеотидов, связывающихся с определенным геном для формирования троичной спиральной структуры, исключающей возможность транскрипции.

Несмотря на то что коррекция генетического заболевания на уровне генома остается наиболее оптимальным и предпочтительным терапевтическим методом, мРНК также является перспективным вектором (возможно даже более доступным) для блокировки доминантного негативного гена. С целью ингибирования трансляции и/или повышения деградации мРНК уже давно используются белковые молекулы с антисенсовыми олигонуклеотидными или полными последовательностями, блокирующими связывание мРНК с биосинтетическим аппаратом клетки. Кроме того, двуцепочечная РНК индуцирует стремительную деградацию мРНК, механизм которой остается до конца не выясненным. Однако маловероятно, что одно лишь устранение мРНК, транскрибированных с мутантного аллеля с короткими или единичными мутациями, будет способствовать экспрессии мРНК нормального аллеля. Альтернативу представляет использование рибозинов hammerhead и hairpin, обладающих способностью связываться с высокоспецифическими участками мРНК с последующей индукцией их расщепления и инактивации в процессе трансляции. В настоящее время изучается возможность применения данного метода в терапии патологического остеогенеза. Независимо от того что именно является мишенью - геномные или цитоплазматические элементы, успех новых технологий генной терапии будет определяться эффективностью включения реагентов в стромальные клетки костного мозга ех vivo, оптимального выбора специфического вектора и стабильной способности мезенхимальных стволовых клеток экспрессировать нужные факторы in vivo.

Таким образом, открытие мезенхимальных стволовых клеток с их неожиданными свойствами создает новую концептуальную схему развития клеточных линий. Однако для понимания биологической роли стромальных стволовых клеток, их природы, способности к трансдифференцировке или дедифференцировке, их физиологического значения в процессе эмбрионального развития, постнатального роста, созревания и старения, а также при заболеваниях человека необходимы дальнейшие междисциплинарные исследования.